免疫组织化学染色技术
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点摘要：一、免疫组织化学染色的概念二、免疫组织化学染色的原理三、免疫组织化学染色的方法四、免疫组织化学染色的应用五、免疫组织化学染色的优缺点正文：免疫组织化学染色是一种将免疫学原理应用于组织学的方法，通过化学反应使组织中的抗原与抗体结合，从而检测特定抗原在组织中的分布和表达情况。
该技术广泛应用于生物学、医学等领域，对疾病诊断、研究及治疗具有重要意义。
免疫组织化学染色的原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。
首先，通过化学或物理方法暴露组织中的抗原，然后用特异性抗体与抗原结合，最后通过显色反应检测结合情况。
常用的显色方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等。
免疫组织化学染色方法包括以下几个步骤：1.组织处理：固定、脱水、透明、浸蜡等；2.抗原修复：去除组织中的封闭抗原，暴露目标抗原；3.免疫染色：用特异性抗体与抗原结合；4.显色：检测抗体与抗原结合后的显色反应；5.观察和分析：通过显微镜观察染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况。
免疫组织化学染色技术在生物学和医学领域具有广泛应用：1.疾病诊断：通过检测特定抗原的表达，辅助诊断疾病，如肿瘤、炎症等；2.疾病研究：研究抗原在疾病发生和发展过程中的作用机制；3.药物研发：检测药物对特定抗原的影响，评估药物疗效；4.肿瘤分期和预后评估：通过检测肿瘤组织中抗原的表达情况，评估肿瘤分期和预后。
免疫组织化学染色技术具有以下优缺点：优点：1.高敏感性：能够检测微量抗原；2.高特异性：特异性抗体与抗原结合，减少交叉反应；3.定位准确：显示抗原在组织中的分布和表达情况；4.易于操作：方法简单，仪器设备要求较低。
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定分子的存在和定位。
它基于免疫反应的原理，即针对特定抗原的特异性结合。
免疫组织化学染色的步骤包括固定、抗原解脱、抗原检测和染色四个主要步骤。
首先，需要将组织固定在载玻片上，通过化学处理来保留组织结构和抗原的位置。
然后，通过抗原解脱的步骤，去除组织中的其他成分，使得需要检测的抗原能够更好地暴露出来。
接下来，进行抗原检测。
这一步骤在免疫组织化学染色中非常关键，它使用特异性的抗体来与待检测的抗原结合。
抗体可以来源于动物、人类或是由基因工程技术合成。
最后，进行染色步骤。
常用的染色方法有酶标记技术和免疫荧光染色。
在酶标记技术中，抗原和抗体结合的位置会形成反应物质，如染色剂或显色物质，使得抗原的位置能够被视觉观察到。
而在免疫荧光染色中，抗体通常会被标记上荧光物质，其发出的荧光信号能够在显微镜下被观察到。
免疫组织化学染色的原理是利用抗体与抗原特异性结合来检测特定分子在组织中的存在和定位。
这种技术被广泛应用于医学研究、疾病诊断和药物研发等领域，为我们提供了对组织内分子进行定性和定量分析的重要工具。
免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
免疫组织化学染色技术
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
免疫组织化学染色诊断液盖膜涡流混匀法
免疫组织化学染色诊断液盖膜涡流混匀法1. 免疫组织化学染色简介免疫组织化学染色是现代医学实验室中不可或缺的一项技术，它帮助我们检测组织样本中的特定抗原。
简单来说，就是通过染色让我们能够在显微镜下看到我们想要的东西。
就像在黑暗的房间里用手电筒找东西一样，通过染色，我们的目标变得“发光”，从而可以很容易地被发现。
这种技术对于疾病的诊断和研究特别重要，尤其是对各种癌症和其他疾病的早期发现和确诊有着极其重要的作用。
2. 涡流混匀法简介而涡流混匀法，这个名字听起来有点复杂，但实际操作起来也没那么神秘。
它主要是为了确保在免疫组织化学染色中，染色液的均匀混合。
为什么混合这么重要呢？因为如果混合不均，染色效果可能就会有差异，这就像做蛋糕时面粉没搅拌均匀一样，最后出来的蛋糕可能会有一块是面粉饼，一块是没有面粉的。
我们不想让我们的实验结果出现这样的“烤糊”的情况，对吧？3. 涡流混匀法的具体操作3.1 准备工作首先，我们要准备好所有需要的材料和设备。
包括免疫组织化学染色液、涡流混匀器，还有盖膜。
这些东西好比是你做饭时的锅碗瓢盆，不到位的话，结果肯定不如意。
你可以想象一下，涡流混匀器就像是一个小小的搅拌器，它能帮助你把染色液混合得均匀，就像用搅拌器搅拌奶昔那样轻松方便。
3.2 涡流混匀接下来是最关键的部分——混合。
把染色液倒入一个小瓶里，放到涡流混匀器上，然后打开开关。
涡流混匀器会产生一个强烈的旋转涡流，把液体搅拌得非常均匀。
这个过程就像是你用力摇晃瓶子一样，摇到最后，瓶子里的东西都被彻底混合了。
混合的时间通常不需要很长，几分钟就够了。
这时，你会发现，液体的颜色变得更加均匀了，这就是混合好的标志。
3.3 盖膜操作混合完成后，接下来是盖膜步骤。
这一步也很重要，它就像给你的蛋糕上面盖上保鲜膜，以防蛋糕变干。
盖膜的目的是为了防止染色液在储存或使用过程中蒸发或被污染。
你需要小心翼翼地将盖膜贴在液体瓶口上，确保每一处都贴得牢牢的，没有漏缝。
免疫组织化学染色技术
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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它可以用于检测细胞和组织中的特定蛋白质或其他分子。
这种技术主要基于抗体与抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现染色。
下面是免疫组织学化学染色的步骤：
1. 取样：首先需要从组织或细胞中取得样品。
这可以通过活体组织切片、细胞培养等方法来实现。
2. 固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构不变。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛、乙酸等。
3. 脱水：将样品逐渐浸泡在不同浓度的乙醇中，以去除水分，使其逐渐变得透明。
4. 渗透：将样品逐渐浸泡在不同浓度的蜡中，使其逐渐渗透并浸润其中。
5. 切片：将样品切成非常薄的切片，通常为3-5微米。
6. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫原性。
常用的抗原修复方法包括加热、酶解、酸解等。
7. 阻断：将切片浸泡在蛋白质阻断剂中，以防止非特异性结合发生。
8. 一抗：将特异性的一抗加入到切片中，使其与目标抗原结合。
9. 二抗：加入与一抗结合的标记二抗，以形成一抗-二抗复合物。
10. 染色：加入染色剂，使标记二抗发生染色反应，从而可视化目标抗原的分布和定位。
11. 脱色：将多余的染色剂去除，使切片变得清晰可见。
12. 封片：将切片用透明胶封装，以保护其结构和形态。
以上就是免疫组织学化学染色的步骤，这种技术可以用于研究细胞和组织中的蛋白质、细胞因子、核酸等分子，为生物医学领域的研究和诊断提供了重要的工具。
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。
2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。
4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7.PBS冲洗，5分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9.PBS冲洗，5分钟×3次。
10.显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，封片。
12.冰冻切片免疫组化染色步骤。
13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分
钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
【原创实用版】
目录
1.免疫组织化学染色的概念和原理
2.免疫组织化学染色的方法和步骤
3.免疫组织化学染色的应用和案例
4.免疫组织化学染色的发展趋势和前景
正文
一、免疫组织化学染色的概念和原理
免疫组织化学染色是一种通过抗原抗体反应的原理，检测组织切片中特定抗原的表达情况，并将其染色显示出来的技术。
这种技术广泛应用于疾病诊断、病情监测、疾病研究等领域。
二、免疫组织化学染色的方法和步骤
免疫组织化学染色的方法主要包括 LSAB 法和 SP 法。
这两种方法的步骤大致相似，主要包括切片处理、抗原修复、抗体孵育、复合物孵育、染色和核染色等。
1.切片处理：包括切片脱蜡至水、H2O2 甲醇处理切片、水洗等。
2.抗原修复：通过加热或化学方法，使组织切片中的抗原得到修复。
3.抗体孵育：将特异性抗体与组织切片孵育，使其与抗原结合。
4.复合物孵育：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
5.染色：加入染色剂，如 DAB-H2O2，使免疫复合物呈现颜色。
6.核染色：用苏木素等染料染色，使细胞核呈现颜色。
三、免疫组织化学染色的应用和案例
免疫组织化学染色在临床诊断、疾病研究、肿瘤生物学等领域有着广泛的应用。
例如，通过免疫组织化学染色可以检测肿瘤组织中的癌基因、肿瘤标志物等，帮助医生诊断病情、制定治疗方案。
四、免疫组织化学染色的发展趋势和前景
随着科学技术的发展，免疫组织化学染色技术也在不断发展和完善。
Ge免疫组织化学染色技术
Mallory三色染色法：染料试剂：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红、重铬酸钾、磷钨酸、醋酸免疫组织化学的要紧染色方式第一篇概述免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反映，检测细胞或组织中是不是有目标抗原的存在，此方式不只能够用来测知抗原的表现量也可观看抗原所表现的位置。
只若是能够让抗体结合的物质，也确实是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
染色注意事项：一、直接法二、间接法三、未标记抗体法抗体和酶、荧光素结合后，或多或少的降低了抗体与抗原的结合能力。
有酶桥法和PAP法，但前者短处较多。
PAP法（Peroxidase Antiperoxidase. PAP)PAP复合物（二分子抗体，三分子酶），体积小，稳固，穿透性好特点：较间接法灵敏20~100倍，较前几种方式非特异性染色轻。
四、ABC 法（Avidin-Biotin-Complex Method）Avidin——卵白素，有四个亚单位，每一个亚单位有138个氨基酸，分子两68kD。
一个卵白素分子能与4个分子的生物素结合，大体上不可逆，比抗原抗体结合力大1000000倍，只有在的条件下才能将其分离。
Biotin——生物素，一分子的抗体可结合150个生物素分子，和多种酶结合后，不阻碍催化活性。
四、LAB法（ Labeled Avidin-Biotin）特点：1.灵敏性较PAP法提高20~40倍；2.非特异性染色几乎没有；3.可用于IHC，核酸杂交等五、免疫组织化学染色方式的选择原那么五个“S”原那么特异性间叶组织，上皮组织恶性肿瘤，多克隆抗角蛋白抗体，特异性广鳞状上皮或腺上皮，单克隆抗角蛋白抗体，特异性高；灵敏性灵敏性高，特异性下降，假阳性增加；灵敏性低，特异性高，假阴性增加；简便性选用方式愈简便愈好；平安性(time and money)第二篇：免疫组织化学要紧方式举例步骤取材：要紧来源于活检标本、手术切除标本及尸身解剖标本。
免疫组化名词解释
免疫组化名词解释
免疫组化的全称是免疫组织化学染色技术，是病理科进行病理检查常用的一种技术手段，是在分子水平上协助进行病理诊断的一种方法。
免疫组织化学染色技术是利用免疫学原理，通过抗原抗体产生特异性反应，从而鉴定出某种化学物质或者某种特异性抗原在组织或细胞中的形态、组织来源、分化程度以及组织亚型等情况。
进行免疫组化染色，可以帮助鉴别肿瘤的性质，判断肿瘤的原始细胞。
所以临床上经过普通或H1染色的病理检查后，如果不能判断所检测标本的性质，就需要进行免疫组化检测，通过免疫组化染色技术可以增加诊断的准确性。
第七讲 免疫组织化学染色原理和方法
间接法与直接法相比，有两个突出的优点
1. 标记的第二抗体可通用于多种抗原的定位；
2. 敏感度大为提高。因为每个抗原分子可以与1个 以上的抗体分结合，假设组织抗原分子与4个第 一抗体分子结合，每个第一抗体（作为第二抗体 的抗原）分子又与5个第二抗体分子结合。在直 接法中，一个抗原分子只能连接4个标记物分子， 而在间接法中，一个抗原子连接了20个标记分子。 抗原分子连接的标记物分子越多，发色强度越大， 敏感度也愈高。
Wash with PBS pH 7.5, 3-times 10 min. Incubate 2nd antibody in 1% BSA, PBS pH 7.5, 60
min at r.t.; e.g., goat anti-rabbit Texas Red (Accurate), 1:80
Wash with PBS pH 7.5, 3-times 10 min.
补体结合免疫荧光法
双标记法
Drain off PBS with any of the above mentioned fixation methods.
Wash in PBS 3-times 5 min. Permeabilize with 0.01% Triton X-100 in PBS for
（一）免疫荧光技术
1. 用荧光抗体对细胞、组织切片或其பைடு நூலகம்他标本中的抗原（或抗体）进行鉴 定和定位检测，可在荧光显微镜下 直接观察实验结果，或是应用流式 细胞术进行自动分析检测；
2. 用于检测体液标本中抗原或抗体， 即荧光免疫测定。
1. 免疫荧光显微技术
1. 直接法 ：把荧光素直接标记在特异性抗体（第一抗体）上其优点是特 异性强，操作时间短，但敏感度低，而且需要多量的抗体。
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法)
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法) 免疫组织化学染色诊断是一种常用于病理学研究和临床诊断的技术，可以通过对组织切片中的特定抗原进行染色，来确定细胞或组织中的特定蛋白质分子的存在、分布和表达水平。
液盖膜涡流混匀法是一种常用的免疫组织化学染色方法，其基本步骤如下：
1. 组织标本的制备：取得需要检测的组织标本，经过处理后制备成切片。
2. 抗原解析：将切片进行抗原解析处理，使得目标蛋白质在切片上暴露出来。
3. 抗体处理：将特异性抗体添加到切片上，并进行孵育，使得抗体和目标蛋白质结合形成免疫复合物。
4. 二级抗体处理：添加与特异性抗体结合的二级抗体，并进行孵育，使得二级抗体与特异性抗体结合。
5. 染色处理：使用染色剂进行染色处理，使得免疫复合物能够被可视化。
6. 直接涡流混匀：将液盖膜盖在切片上，使用混匀仪进行混匀。
该方法主要优点是操作简便、染色效果较好、敏感性和特异性高等，适用于多种组织和细胞的检测。
1/ 1。
免疫组织化学染色技术
（二）各染色(rǎnsè)步骤的具体操作及注意事项
1. 组织材料的采取
活检(huójiǎn)组织
组织标本 手术切除标本
尸检标本
实验组织或培养细胞
活检(huó jiǎn)组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内 窥镜钳取的组织
体积小，因活检(huó jiǎn)钳直接钳取，常受压过度而
1. 免疫酶细胞化学(huàxué)技术 2. 免疫荧光细胞化学(huàxué)技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学(huàxué)技术
第五页，共93页。
一、免疫组织化学染色方法的原理
抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机 体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫 应答产生的效应物质（抗体和效应细胞） 在体内或体外发生特异性结合(jiéhé)反 应的物质。抗原具有两种性能：
PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 ºC，同时滴入1N NaOH 至溶液 完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将 溶液加至1000ml。 ¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 ¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生(chǎnshēng)固定 作用。
第二十三页，共93页。
4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作
防脱片剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨酸 （Poly-L-lysine）、甲醛(jiǎ quán)-甘油明胶。
（1）免疫原性（immunogenicity） 指 抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的 特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗 原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答
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显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部
位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。 通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜 下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在 与否。
2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其 中以酶标抗体法应用最为广泛。
3. 组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋
（1）脱水 脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常 用酒精。 酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强， 并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组 织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应 从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下 或4 º C下进行，以减少抗原的损失。 70% 80% 90% 95% 100% 100%
（3）浸蜡
组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程 称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡 浸渍。
用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温 蜡，在60 º C以下浸透。
（4）包埋
浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡 到入包埋盒，冷却后取出，修块。
4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作 防 脱 片 剂 ： 3- 氨 基 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 （ 3aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨 酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明胶。 APES 涂片的制作 原理： APES 是一种新型玻片粘附剂，与一般 的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰 作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片 牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。 具体操作方法： 将载玻片用酸处理后，用95%酒精浸泡，再用 绸布擦干，清除表面的污渍；
（2）水洗
冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定 时 间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗 24 小时，小动物组织冲洗2-10小时。 新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短， 固 定时间长的标本，冲洗时间也需延长。 冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并 扎 紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一 端
（二）各染色步骤的具体操作及注意事项
1. 组织材料的采取
活检组织 组织标本 手术切除标本 尸检标本 实验组织或培养细胞 活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织 体积小，因活检钳直接钳取，常受压过度而变性，因此， 活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的 病灶区。 抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑 切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。
2. 组织块的固定、水洗
（1）固定液：种类较多，常用的有以下2种： 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法： 10 ml 40% 甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)， 还可形成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶) 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 º C，同时滴入1N NaOH 至溶 液完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将溶液加至1000ml。 ¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 ¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。 甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。 ¶ 不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的 抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与
切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色， 显示出所检测的目的抗原的部位。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和
性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特 异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠 制备的单克隆抗体。
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O2 HRP ·H2O2 HRP ·H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如： CN为蓝色 TMB为深蓝色 AEC为红色 DAB为棕色
一、免疫组织化学染色方法的原理
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能： （ 1 ）免疫原性（ immunogenicity ） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。 （ 2 ）反应原性（ reactogenicity ）指抗原分子与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。 ALP 标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高 的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。 由于组织细胞内含有内源性 ALP ，在显色液中需加入 终浓度为 2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性 ALP活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为-D-葡萄糖67mg、 NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37º C孵育1小时， 生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片 可经脱水、透明后封片，长期保存。
第三节 免疫组织化学染色步骤
（一）ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤 1. 组织材料的采取； 2. 组织块的固定； 3. 组织块的脱水、透明及石蜡包埋； 4. 石蜡切片的制备； 5. 石蜡切片的脱蜡及水化； 6. 抑制内源性过氧化物酶活性； 7. PBS洗涤切片； 8. 抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原； 9. PBS洗涤切片；
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。 （2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体） 孵育切片 发色剂显色 （核复染）
二、光学显微镜下的组织学染色方法
• 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） • 组织学特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、 细胞DNA和RNA的染色等 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的 形态改变。
10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时 加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附； 11. 用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片； 12. PBS（可加入Tween 20#，PBST）洗涤切片； 13. 用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片； 14. 用PBS或PBST洗涤切片； 15. 滴加SP试剂或ABC试剂； 16. PBS或PBST洗涤切片； 17. DAB或AEC显色； 18. 自来水洗涤切片，终止显色； 19. 用苏木素做核复染； 20. 切片脱水、透明，树胶封片。
三、超微结构的观察
• 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。 • 电镜的分辨率最佳可达 0.14nm ，放大倍率最高可达 100 万倍。
第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
2. 抗原的分类
完全抗原、半抗原
免疫学分类
胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿 瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、 血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物 等之间存在的共同抗原
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B 淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。 大部分抗体电泳后位于 区带， 1972 年国际免 疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋 白分子统一命名为免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) 。
免疫组织化学染色技术
第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类： 一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如： 脂肪组织染色法 目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥 样硬化大体标本的染色