NDV抗血清制备及抗体效价测定
鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用
鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用报告如下：1 材料1.1 病毒DHAV-3致弱疫苗毒（B54株）、DHAV-1（ATCC株）、鸭瘟疫苗株病毒（DPV），由武汉中博生物股份有限公司保存。
1.2 抗体ELISA检测试剂盒禽流感病毒（AIV）抗体、传染性支气管炎病毒（IBV）抗体、鸡新城疫病毒（NDV）抗体、传染性喉气管炎病毒（ILTV）抗体、禽传染性法氏囊病毒（IBDV）抗体、鸡贫血病毒（CAV）抗体、禽白血病病毒（ALV）抗体、禽脑脊髓炎病毒（AEV）抗体、禽呼肠孤病毒（REO）、网状内皮组织增殖病毒（REV）抗体检测试验盒，均购自北京IEDXX公司。
1.3 检测用抗原和抗体减蛋综合征病毒（EDS76）HA抗原，DHAV-1和DHAV-3鸭阳性血清及阴性血清均由武汉中博生物股份有限公司制备、鉴定和保存。
1.4 培养基无菌检验培养基：硫乙醇酸盐培养基（T.G），酪胨琼脂培养基（G.A），葡萄糖蛋白栋培养基（G.P）；支原体培养基：改良Frey氏固体和液体培养基，均购自北京海淀中海动物保健科技公司。
1.5 试验动物SPF鸡3周龄，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸭种蛋购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；10日龄鸭胚和易感雏鸭，均购自武汉市畜牧兽医科学研究所；10日龄SPF鸡胚，用购自济南斯帕法斯家禽有限公司SPF种蛋进行自孵。
2 方法2.1 抗血清的制备2.1.1 免疫原的制备与纯化将DHAV-3 B54株种毒1：1000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚，每胚0.1ml，置于37℃孵化箱继续孵化，不必翻蛋。
收集36～96h死亡鸭胚，无菌收集尿囊液。
纯化方法为：将收获的尿囊液装入透析袋，用PEG20000进行包埋浓缩处理，待体积浓缩至原体积的1/50时，10000r/min离心60min，取上清液，再在同样条件下45000r/min离心150min，弃去上清，再加入等体积灭菌PBS，悬浮沉淀物，-20℃冻存备用[8]。
抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清制备原理、步骤及应用抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。
一、抗血清制备原理：将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。
可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。
抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。
二、抗血清制备步骤：1、选择免疫动物➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。
２、抗原制备➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。
加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。
➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。
制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。
检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。
若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。
３、确定免疫方案➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。
可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。
免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。
若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。
免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种用于确定特定抗体在溶液中的浓度的测试方法。
制定抗体检测方案的目的是为了发现一些疾病或病菌感染后体内的抗体水平，以便给这些人提供更好的诊断和治疗方案。
抗体检测可以帮助诊断多种疾病和监测免疫应答。
抗体效价检测的步骤：1. 确定抗原：首先，需要选择与所检测试物一致的合适抗原。
可以是病原体中的某个蛋白质、脂多糖、多糖等化合物。
2. 制备样品：接下来，需要制备出一定浓度的抗原，然后制备一定浓度的粗抗血清作为实验对象，这里抗血清就是被免疫动物或人的血清。
3. 设置不同浓度的样品和抗体：设置一系列不同浓度的测定样品和一定浓度的抗体，一般会先制作含有较多抗体的肯定样品和不含抗体的阴性对照样品。
4. 混合样品和抗体：添加不同浓度的抗体到不同浓度的抗原溶液中或在不同浓度的抗原中加入相同浓度的抗血清，稀释一定倍数（常用2倍）后，把稀释完后的溶液混合均匀。
5. 反应：将混合物加入试剂板中，以促使抗体与抗原结合并发生反应，在一定的条件下，让其反应一定的时间（常用30分钟到数小时）。
6. 洗涤：去掉未结合的物质，洗刷试管或板，这是为了减少误差，使试验结果更加可信。
7. 加入检测酶标记二抗：在试管或板中加入检测酶标记的二抗，这通常是一种抗体，其可与被检测抗体特异性结合。
8. 再次洗涤：去掉未结合的物质，称为第二次洗涤。
9. 加入底物：加入相应的酶底物，以促使反应物下一步的曝光和输送。
10. 停止反应：反应一定时间（通常为10–30分钟），使颜色发生变化，这里会加入用于停止反应的酸或酵素抑制剂。
11. 测定结果：测定反应颜色的浓度，以反映所检知物的含量，从而确定抗体效价，也就是可以得到测量结果，用来确定抗体的水平。
抗体效价检测是一种非常重要的诊断方法，它可以帮助医生和研究人员快速探讨细菌和疾病的数量变化，进而制作出更有效的治疗和疫苗。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常用的方法，用于评估抗体样品的质量和活性。
该检测可以确定抗体样品中所含抗体的浓度以及其与靶标结合的能力。
以下是抗体效价检测的一般步骤：1. 制备样品和控制组：首先需要准备抗体样品和相应的阳性和阴性对照物。
阳性对照物是对于靶标已知有高亲和力的抗体样品，而阴性对照物则是不包含任何抗体的样品。
2. 稀释样品：将抗体样品进行连续稀释，通常从高浓度开始，以便确定抗体效价的范围。
每一次稀释应按照一定比例进行，如1:2或1:10等。
3. 设置试验板：将稀释好的抗体样品、阳性和阴性对照物，以及含有靶标的试验物添加到试验板中的孔中。
每个样品应设置多个孔，以获得平均效价。
4. 孵育：将试验板置于孵化器中，在适当的温度和时间下进行孵育。
这有助于抗体与靶标结合，并形成固定复合物。
5. 洗脱：将试验板的孔洗脱干净，以去除未结合的抗体。
这可以通过重复洗涤孔中添加和去除缓冲液来实现。
6. 反应：加入检测抗体，这是一种能与固定复合物中的抗原结合的二抗。
检测抗体通常被标记，以便进行可视化。
典型的标记物包括酶，如辣根过氧化物酶（HRP），或荧光染料，如荧光素等。
7. 反应孵育：将试验板放回孵化器中，在合适的温度下进行孵育。
这有助于检测抗体与固定复合物结合，并形成更大的复合物。
8. 洗脱：类似于步骤5，洗涤试验板的孔，以去除未结合的检测抗体。
9. 可视化：根据检测抗体的标记物，对于酶标记的检测抗体可以加入亮色底物，并观察色素的产生。
对于荧光标记的检测抗体，则可以在荧光显微镜下直接观察发光信号。
10. 数据分析：根据样品和对照组的可视化结果，测定抗体效价。
通常使用半最大抗体效价（EC50）来表示抗体效价，即抗体浓度在50%时与靶标结合。
抗体效价检测是一个常见的实验技术，它在抗体研究和生物医学领域有着广泛的应用。
通过正确执行上述步骤，可以准确地确定抗体样品的效价和活性，进一步支持科研和临床应用。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 Hessen was revised in January 2021抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200μL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种测定抗体的浓度及活性的方法，通常用于评估抗体的质量和效能。
以下是抗体效价检测的一般步骤，供您参考。
1. 制备样本：首先，从动物体内或培养物中收集抗体样本。
例如，可以从实验动物体内收集抗体样本，或从培养的细胞上清液中收集抗体样本。
确保样本的收集过程在符合生物安全标准的条件下进行。
2. 稀释样本：抗体样本通常会被稀释，以确保在合适的浓度范围内进行测定。
稀释倍数的选择应根据抗体的预计浓度和检测方法的灵敏度来确定。
3. 样本预处理：根据实验的需要，可能需要对样本进行一些处理。
例如，可以对样本进行加热、酶处理或亲和纯化等步骤。
4. 准备控制组：在进行抗体效价检测之前，还需要准备一些控制组。
这些控制组可以包括阴性对照、阳性对照和参考标准，用于确保检测结果的准确性和可靠性。
5. 测定方法选择：根据实验的需要和可用的设备/试剂，选择适合的抗体效价测定方法。
常见的方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等，可根据实验目的选择不同的方法。
6. 进行测定：按照选定的方法操作，将稀释的样本和控制组加入适当的载体（如微孔板）中，与相应的检测试剂反应。
通过适当的信号检测方法，如吸光度测定、荧光测定或放射免疫测定等，测量不同样本的信号强度。
7. 数据分析：使用适当的软件或计算方法，对测定结果进行数据分析。
根据标准曲线、控制组和参考标准的结果，计算样本中抗体的浓度或抗体效价。
8. 结果解释：根据测定结果，对抗体样本的浓度或效价进行解释。
可以根据人体抗体效价的标准范围，判断抗体活性和质量的好坏。
9. 结果验证：为了确保结果的准确性，可以进行结果的验证实验。
例如，可以通过再次测定部分样本或使用其他独立的方法进行验证。
以上是抗体效价检测的一般步骤，实际操作中可能会有些差异，具体步骤可能会根据实验目的、检测方法和设备要求等因素进行调整。
在进行抗体效价检测时，一定要严格按照实验操作规程进行，确保结果的准确性和可靠性。
鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定
鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定银梅;孔令芸;张秋雨;丰兰竹;周洁;岳锋;王选年【摘要】本研究采用鸡胚繁殖NDV-XX08,差速离心法纯化NDV,用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠的脾细胞与NSO细胞进行融合,用间接ELlSA和血凝抑制试验(HI)进行筛选,挑选效价高的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆,建立阳性杂交瘤细胞株,最终得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为4F12.采用体外细胞培养和体内诱生腹水的方法制备了其McAb.对获得的单克隆抗体采用ELISA,HI,Western-Blotting方法进行鉴定.杂交瘤细胞培养上清和腹水的ELISA 效价分别为1∶160和1:3.2×104.获得的单克隆抗体与NDV具有良好的特异性反应,与鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织、鸡IgG、鸡传染性囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感检测抗原均无交叉反应性.HI试验表明,制备的单抗没有血凝抑制活性.Western-Blotting证明获得的单抗与新城疫病毒蛋白有特异性反应.经连续传代20次,冻存、复苏3次,4F12杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2016(052)002【总页数】4页(P3-5,8)【关键词】鸡;新城疫病毒;单克隆抗体;Western-Blotting【作者】银梅;孔令芸;张秋雨;丰兰竹;周洁;岳锋;王选年【作者单位】河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;新乡市红旗区动物疫病预防控制中心,河南新乡453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;新乡学院生命科学技术学院,河南新乡453003;新乡学院生命科学技术学院,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.5鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)引起禽类的一种急性传染病,是对养鸡业危害最大的传染病之一.NDV属于禽腮腺炎病毒属,只有一个血清型,但各毒株间的毒力和对鸡的致病性有很大差异,常规的血凝抑制试验不易检测出抗原结构的差异.单克隆抗体具有识别单个抗原决定簇的特异性.在ND诊断上,应用单克隆抗体可以检测不同NDV毒株间表面抗原结构的差异,具有快速、灵敏和特异性强的优点,因此利用单抗建立ND诊断的报道也越来越多.如卢建红等[1]利用抗NDV单抗建立了PEG-ELISA技术,庄向生等[2]利用NDV单抗建立了DFA技术.本试验用新乡地方株新城疫病毒NDV-XX08作为抗原,通过细胞杂交技术制备抗NDV的单克隆抗体,并对单抗的特异性进行了鉴定,为进一步NDV生物学特性的研究及快速诊断方法的建立奠定基础.1.1 材料1.1.1 实验动物和细胞BALB/c小鼠(6-8周龄),购自郑州大学医学院;小鼠NS0细胞,由本实验室提供;9日龄SPF鸡胚,购自梅里亚维通实验动物技术有限公司.1.1.2 主要试剂和病毒PEG-1500(聚乙二醇), Sigma公司;IFA(弗氏不完全佐剂)、CFA(弗氏完全佐剂),Pierce公司.鸡新城疫病毒(NDVXX08)本实验室分离保存.1.2 方法1.2.1 病毒的繁殖与纯化采用鸡胚尿囊腔接种病毒的方法繁殖NDV-XX08,将NDV-XX08尿囊液在4℃条件下采用差速离心法进行纯化.将100 mL尿囊液依次3 000 r/min离心10 min,5 000 r/min离心10 min,6 000 r/min离心10 min;取上清,再15 000 r/min离心2.5 h;取沉淀,用0.5 mL生理盐水悬浮,检测其280 nm 处的吸光值,并计算病毒蛋白含量,-20℃保存备用.1.2.2 免疫小鼠取6周龄雌性BALB/c小鼠,将纯化的NDV与佐剂完全乳化免疫,免疫剂量为50～100 μg/只.首免用弗氏完全佐剂(CFA);加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA).加强免疫3次,每次间隔14 d.最后1次免疫第10天,检测抗体水平,抗体效价符合要求的小鼠,在融合前3 d,尾静脉注入50 μg不加佐剂的抗原进行超强免疫.1.2.3 ELISA筛选方法的建立先固定NDV抗原的浓度,将BALB/c小鼠阳性血清作倍比稀释,读取OD450nm值,确定抗血清的最佳工作浓度,然后在抗血清最佳工作浓度下,确定抗原的最佳工作浓度.1.2.4 小鼠血清效价的测定将免疫小鼠断尾采血,分别用间接ELISA和HI试验检测抗体效价.1.2.5 杂交瘤细胞株的建立取抗体水平符合融合要求的免疫BALB/c小鼠,处死,取脾细胞,与NS0细胞融合,融合剂为PEG-1500,融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100 μL/孔,培养.1.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选采用间接ELISA方法和HI试验进行阳性孔筛选,间接ELISA筛选时,用NDV-XX08作为包被抗原,同时用SPF鸡胚阴性尿囊液做对照,筛选出不与阴性尿囊液交叉反应的阳性孔.1.2.7 杂交瘤细胞的克隆采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆和亚克隆.1.2.8 单克隆抗体的诱生(1)体外诱生:阳性克隆化杂交瘤细胞转到24孔培养板或细胞培养瓶中,扩大培养,待细胞长满时停止换液,直至细胞全部死亡,收集培养上清,测定其ELISA效价; (2)体内诱生:选择经产BALB/c雌性小鼠,腹腔注入无菌液体石蜡,0.5 m L/只.10 d后,取阳性克隆化杂交瘤细胞,离心,GNK溶液洗涤,用无血清1 640培养基调整细胞数量,将细胞注入预处理的小鼠腹腔,5X106个细胞/只.待小鼠腹部明显膨大时,收集腹水,将腹水3000 r/min(4℃)离心30 min,收集中间清液,-20℃保存.1.2.9 单克隆抗体的鉴定(1)单克隆抗体效价的测定:用间接ELISA和HI检测杂交瘤细胞培养上清液和腹水抗体效价;(2)单克隆抗体的交叉反应性鉴定应用间接ELISA试验将阳性杂交瘤细胞培养上清分别与NDV、禽流感检测抗原(H5-4、H5-5、H5-6、H9)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织液,鸡IgG进行交叉反应鉴定,测定抗NDV单克隆抗体的特异性.各样品的包被浓度与NDV相同;(3)Western-Blotting鉴定:将NDV样品进行SDS-PAGE电泳,对照组用考马斯亮蓝染液染色.试验组将蛋白转移到NC膜上,漂洗,封闭,加入酶联抗体温育,漂洗,加入生色底物进行特异性显带;(4)杂交瘤细胞稳定性测定:将杂交瘤细胞连续培养20代,反复冻存、复苏3次,检测其效价.2.1 病毒的纯化NDV-XX08尿囊液血凝效价为211.尿囊液经差速离心纯化,病毒的血凝效价是216.经计算纯化NDV的蛋白含量为8.6 mg/mL.2.2 ELISA筛选方法的建立结果2.2.1 阳性血清最佳工作浓度包被抗原NDV的浓度固定,选择OD450nm值在1.0左右,P/N≥2.1比值最大的稀释浓度为最适工作浓度.通过表1确定小鼠血清最佳工作浓度为1∶2 000倍稀释.2.2.2 检测抗原最佳工作浓度P/N≥2.1,OD值接近1.0的反应孔的最大稀释度作为抗原最佳工作浓度,通过表2确定抗原最佳工作浓度为1∶800.2.3 免疫小鼠血清抗体效价免疫BALB/c小鼠血液抗体效价为ELISA效价高于1∶1 600,HI效价高于1∶400,符合脾细胞融合要求.2.4 阳性杂交瘤细胞的建立经检测筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞,并进行克隆、亚克隆.最终筛选出一株能分泌阳性抗体的杂交瘤细胞,其命名为4F12.2.5 单克隆抗体的效价检测结果2.5.1 ELISA效价杂交瘤细胞株4F12上清液和腹水间接ELISA效价分别为1∶160,1∶3.2X104.2.5.2 HI效价杂交瘤细胞株4F12上清和腹水血凝抑制效价分别检测,均没有血凝抑制活性.2.6 单克隆抗体特异性鉴定4F12细胞株分泌的单克隆抗体与NDV呈阳性反应,与阴性尿囊液,鸡正常组织液,鸡IgG、H5-4、H5-5、H5-6、H9、IBDV、IBV均呈阴性反应,结果见表3.2.7 SDS-PAGE电泳和Western-Blotting试验结果结果表明,McAb与NDV蛋白在分子质量为66 kDa和43 kDa之间呈特异性反应条带,说明获得的单克隆抗体是针对NDV某个抗原位点的.结果如图1所示.2.8 杂交瘤细胞的稳定性4F12杂交瘤细胞株经连续20代培养,反复冻存、复苏3次,细胞生长良好,并且保持稳定的分泌抗体性.由于免疫程序或免疫方法不合理,导致鸡群整体免疫水平不整齐,在免疫鸡群中越来越多的发生非典型新城疫,加上新城疫病毒不断发生变异,新基因型的出现,给新城疫的临床诊断带来很大的挑战.本研究采用SDS-PAGE和Western-Blotting对NDV结构蛋白进行分析,结果发现,NDV经SDSPAGE电泳在66 kDa-43 kDa之间仅出现两条主要条带,文献报道纯化的NDV进行SDS-PAGE可显示7条多肽[3].原因可能由于NDV的F蛋白,P蛋白,NP蛋白的分子量比较接近,电泳时不容易区分开,也可能样品处理过程中ND病毒结构遭到破坏.Western-Blotting是利用抗体作探针来检测已转移到固相支持物上的靶蛋白.在本研究中,经Western-Blotting试验证明,制备的单抗能与NDV上其中一条多肽链发生特异性反应,此单克隆抗体究竟是针对NDV何种蛋白,还需要继续研究.本研究中获得的单克隆抗体无血凝抑制活性,其机理有待进一步研究.【相关文献】[1]卢建红,张如宽,焦新安,等.快速检测鸡新城疫病毒的聚乙二醇单抗夹心ELISA试验的建立和应用[J].中国兽医科技, 1994,24(2):3-4.[2]庄向生,林天龙,吴平,等.应用直接荧光抗体技术快速诊断鸡新城疫[J].中国兽医科技,1993,23(11):20-22.[3]Chambers P,Millar N S,Bingham R W,et al.Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus,and nucleo⁃tide sequence analysis ot the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminldase and the large protein[J].Gen Virol,1986,67(3):475-486.。
免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
v 10月14日 2.0ml 耳静脉
v 10月25日 2.5mL 耳静脉
一、采血
（一）心脏抽血
v 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再 重复上述操作继续抽血，直至抽完。
v 将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断： （1）待测Ag中至少有几种组分？ （2）待测Ag各组分相对应的Ab的效价？
如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1：X。
v 注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、 清晰度等。
★结果分析
v 1、本实验采用的是什么Ag、Ab？
v 2、 Ag、Ab为什么要设置一系列的 浓度 (方阵排列) ？ “效价”是指Ag的、 还是Ab的？与Ag、Ab的浓度有何关 系？
本次实验目的
1、分析待测抗原的组分数量； 2、测定各组分相应抗血清的效价。
以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗 体效价。
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
四、免疫途径
五、免疫时间间隔
v 羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物， 在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属 关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、 免疫血清的要求以及动物个体等因素。
v 免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。
v 最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在 6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或 用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
免疫血清制备及效价测定
实验的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法.
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内,由动物体内特异的B淋巴 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体.由于抗原分子完全抗原具有多种抗原决定簇,每 一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生针对该决 定簇的抗体,因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体polyclonal antibody.
制备的免疫血清的质量特异性、亲和力及效价高低受多种因素的影响,主 要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案免 疫次数、间隔时间以及免疫佐剂的使用等等.因此要获得高质量的免疫血清需先通 过预实验摸索确定最佳免疫方案.
测定免疫血清中抗体效价的方法很多,如凝集反应、沉淀反应、溶血反应、 ELISA分析等均可用于对抗体效价的测定.
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 SRBC0.2ml,以后分别于第4天、第7天和第10天时间, 以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫.
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器,配合4号针头. 2. 腹腔注射时右手持注射器,左手的小指和无名指抓住小鼠的尾
巴,另外三个手指抓住小鼠的颈部,使小鼠的头部向下.这样腹 腔中的器官就会自然倒向胸部,防止注射器刺入时损伤大肠、 小肠等器官.进针的动作要轻柔,防止刺伤腹部器官. 3. 尤其是对于体重较小的小鼠,腹腔注射时针头可以在腹部皮下 穿行一小段距离,最好是从腹部一侧进针,穿过腹中线后在腹 部的另一侧进入腹腔,注射完药物后,缓缓拔出针头,并轻微旋 转针头,防止漏液.
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价.
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常见的免疫学实验技术，用于评估生物体中抗体的含量和活性水平。
抗体效价检测的步骤如下：1. 样品收集和制备：样品可以是血清、血浆、细胞培养上清等，其中血清样品是最常用的。
在收集血样前需要让被检测者禁食，避免食物中干扰本次实验的物质的干扰，血样采集后需要离心分离血清并进行储存处理。
2. 特异性反应物的制备：特异性反应物可以是抗原、蛋白质或者多肽，也可以是已知抗体或者纯化的Fc片段。
在制备时需要对特异性反应物进行纯化和定量化，并在实验中进行稀释。
3. 准备不同稀释度的样品：可以通过稀释血清进行准备，选用不同的稀释液，逐级进行稀释，直至达到所需的浓度。
4. 确定试验平台：抗体效价检测的平台有ELISA、Western blotting、Flow cytometry、Luminex bead-based multiplexing等，不同平台选择的特异性反应物和检测方法也不同。
5. 设定对照组及实验组：通过添加正对照组和空白对照组样品，可以保证实验结果的准确性和可靠性。
6. 进行免疫反应：将不同稀释度样品和特异性反应物共同作用于试验平台上，进行免疫反应。
7. 检测信号：根据试验平台的不同，可以使用荧光显微镜、生物发光、计数器或者吸光度计等手段检测信号。
8. 数据分析：通过计算各组试验的OD值，构建标准曲线，确定每个样品对应的抗体浓度，计算抗体效价值。
效价值表示一定体积内含有的抗体的数量。
抗体效价检测可以用于诊断疾病、研究疾病的发病机制、疫苗研发等领域，具有重要的应用价值。
但是在进行实验时需要注意反应物的纯度、样品的储存条件、平台的选择和质控等方面，以保证实验结果的准确性和可靠性。
NDV抗血清制备及抗体效价测定
NDV抗⾎清制备及抗体效价测定NDV抗⾎清制备及抗体效价测定【实验⽬的】1. 学习抗⾎清制备的基本原理，掌握兔和⼩⿏免疫注射⽅法、兔颈动脉放⾎、⼩⿏眼球采⾎技术。
2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读⽅法。
3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读⽅法。
4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读⽅法。
PartⅠ. NDV抗⾎清制备⼀、实验原理将具有免疫原性的物质注⼊健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
待动物⾎清中存在⼤量抗体时，采集动物⾎液，分离析出⾎清，便得到所需的抗⾎清（免疫⾎清或抗体）。
由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产⽣多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫⾎清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫⾎清⼜称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。
多克隆抗体的制备是⼀个复杂的过程，为了获得特异性强，效价⾼的抗⾎清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋⽩质类抗原)要加⼊佐剂，以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗⾎清的制备过程。
新城疫病毒（Newcastle diseasevirus，NDV）⼜称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的⼀个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和⽕鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和⼩⽩⿏，制备新城疫病毒抗⾎清。
外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清的制备与检定
外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清的制备与检定孙淼;李岭;李启红;李慧姣;李俊平;杨承槐【摘要】为制备外源病毒检验用抗鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的特异性血清,对300只3～4周龄的SPF鸡进行了基础免疫和加强免疫.最后一次免疫后21d采血并分离血清,血清经混合、分装、冷冻真空干燥后,对其进行了无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定和特异性检验.结果表明,本研究制备的抗IBDV特异性血清无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定均符合《中华人民共和国兽药典》三部(二○一○年版)规定;血清中和效价为1:5747,与IBDV B87株毒种中和指数为104.3,与鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、鸡传染性支气管炎病毒H52株、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、禽呼肠孤病毒S1133株的中和指数均不大于10,通过AGP、ELISA、HI等试验确定血清中不含其他禽源外源病毒抗体.本研究为鸡传染性法氏囊病活疫苗或毒种的外源病毒检验提供了具有良好特异性和高效价的中和用血清.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(049)009【总页数】4页(P11-14)【关键词】鸡传染性法氏囊病;特异性血清;检验【作者】孙淼;李岭;李启红;李慧姣;李俊平;杨承槐【作者单位】中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S852.65鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种侵害禽类的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性疾病[1]。
鸡新城疫(ND)IV系苗免疫鸡群抗体效价的检测
新 城疫 （ Ｄ） Ｎ 是鸡 和火 鸡 的急性 高度接 触性 传染病 ， 属 于 副粘 病毒科 ，腮腺 病毒属 ，在 临床 上表现为 呼吸困难 、 下
痢、 Ｎ机 能紊乱 、 粘膜和浆膜 出血等症状 ， 由于新城 疫引起 的 疾病 首先发现 于印度 尼西亚 的爪 哇和英 国的新城 ， 并分离到 病 原 ， 名为新城 疫 ， Ｏ Ｅ列 为对畜禽危 害最大 的 Ａ类动 故 被 Ｉ 物传 染病之 一 ， 中华人 民共 和国动物 防疫法 》 中华人 在《 和《
试 验 研 究
鸡 新 城 疫 （ Ｉ 系苗 免 疫 ＮＤ） Ｖ 鸡 群 抗体 效 价 的检 测
索南卓玛
（ 海 同德 县畜 牧 兽 医工作 站 ，同德 ８ ２ ０） 青 １ ０ ３
关 键 词 ： Ｄ Ａ 及 ＨＩ 验 ； 体 效价 ； 测 Ｎ Ｈ 试 抗 监
ＤＯ Ｉ ０ ３ ６ ／ ． ： ．９ ９ＪＩ １ ＳＳＮ． ６ － ０ ７．０１ ．３．１ １ ７１ ６ ２ ２ ２０ ０ ３
新 城 疫 病 毒 红细 胞 凝 集 （ Ａ） 验 Ｈ 试 ５ ６ ７ ８ ９ １ ０ ｌ １ １ ２ 对 照
０． ５
滴 度
１２ ：
１４ ：
１８ ：
１ １ ：６
１３ ：２
１６ ：４
１ １８ １２ ６ １５ ７ １ １２ １ ２ ４ ：２ ：５ ：１ ：０ ４ ：０ ８
１． 试 ．２ １
１１ 仪 ．． ３
剂
器
浓缩抗原 、 生理盐水 、ｉ ｖｒ ａｓ ｅ 细胞保 存液 ， ｅ 红
天平 、 离心机 、 恒温箱 、 冰箱 、 微型振荡器 、 微
心 ， 血清析 出后使用 ， 待 每只鸡更换一个 注射器 ， 严禁交叉使
抗血清的制备（多抗的制备）
抗血清的制备（多抗的制备）抗血清的制备（多抗的制备）★ ★telomerase(金币+2,VIP+0):thanks！希望您能够关注木虫生物活动积极投稿，有BB发啊！！有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物用兔，最好用纯种新西兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径背部皮下多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
（三）佐剂佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。
检查合格后即以其中一注射器作注射用。
（四）免疫方法抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。
每2～3周加强免疫一次。
加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价。
如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。
当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。
（五）抗血清的采集与保存家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。
多克隆抗体的制备及抗体效价测定_OK
等比混匀，制成“油包水”乳化液。
24
佐剂与抗原混合乳化的方法： • 研磨法 • 搅拌混合法
25
2. 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
日期（天） 途径
1 皮内
6/7 静脉
11/14 静脉
抗原
热杀死菌 热杀死菌 活菌
剂量（mL）
1.0
0.5
0.2
16/21 静脉 活菌
0.5
21/27 静脉 活菌
1.0
26/34 静脉 活菌
2.0
31
常规制备NDV、VSV抗血清的免疫方案
日期（天） 途径
1 皮内
6/7 静脉
11/14 静脉
16/21 静脉
43
肥达反应结果图
44
血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的 抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集） 的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体 的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。一 般认为，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80 以上，“H”抗体在1：160以上，甲、乙型副伤寒 沙门菌凝集效价在1：80以上才有诊断价值。
白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也
是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲
基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全 佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
实验三 鸡新城疫诊断抗原的制备
实验三鸡新城疫诊断抗原的制备新城疫病毒(NDV)属副黏病毒科成员，含有血凝素，可凝集鸡、鸭、鹅等禽类及人的红细胞，并可被NDV血凝抑制抗体所抑制，可用于病毒血凝(HA)效价及其抗体测定。
但NDV有一定毒力，不能直接作为诊断制剂用于实际生产。
该病毒用一定浓度甲醛作用一定时间，可以失去感染活性，但仍然保留了血凝活性，从而可以作为该病毒HA 抗原。
在养禽生产中，为了测定及鸡群鸡新城疫抗体水平的高低，需用鸡新城疫诊断抗原来检测，下面即以鸡新城疫诊断抗原的制备为例，减少诊断抗原的制备过程。
一、目的意义：掌握鸡新城疫抗原的制备过程和原理二、实验器材：1．材料(1)种毒：鸡新城疫病毒毒种(La Sota株)；(2)实验动物：9～10日龄鸡胚。
(3)主要器材：超净工作台、高压锅、微量加样器、孵卵器(或恒温箱)、蛋盘、检卵器；96孔v形塑料反应板、酒精灯、烧杯、吸管、三角瓶、lml注射器、记号笔、碘酒棉、酒精棉和镊子等。
2．试剂PBS缓冲液(O．01mol／L，pH7．2)、生理盐水、o．5％鸡红细胞液、5％碘酒棉、75％酒精棉、PEG2000、NaCl、甲醛溶液(分析纯，含量36％～38％)和5％的新洁尔灭等。
三、实验内容制备鸡新城疫病毒HA抗原。
四、操作步骤1.病毒增殖(1)种毒以10—4～10—6稀释后，接种9～10日龄鸡胚尿囊腔内，0.1ml胚，用融化的石蜡将卵壳上的接种处封口后37℃继续孵育。
(2)接种后，每日照蛋2次，24h前死亡的鸡胚弃去，将96～120h 死亡的鸡胚及120h时仍未死亡的所有活胚取出，冷却4～24h。
(3)气室部位用5％碘酒棉消毒，然后以无菌法剥除气室部位的蛋壳，掀开蛋壳膜，剪破绒毛尿囊膜和羊膜，吸出鸡胚液，一20℃保存备用。
2．浓缩纯化：取鸡胚尿囊液6000r／mid离心20min，取上清液加入8％PEG2000和1％～2％NaCl，边加边搅拌，4℃过夜，10000r／min 离心6h，弃去上清液后，加入适量PBS，混匀，再经40 000r／min离心2h，取沉淀加入少量PBS，充分溶解。
实验一抗体的制备及效价检测[技巧]
![实验一抗体的制备及效价检测[技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/428164836aec0975f46527d3240c844769eaa08b.png)
实验一抗体的制备及效价检测一、实验目的本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。
二、实验原理机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。
分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。
抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
三、实验步骤1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。
（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。
（3）油剂和水剂1：1混合。
混合方式：研磨或者注射器混合。
4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。
第一次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
NDV抗血清制备及抗体效价测定【实验目的】1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采血技术。
2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。
3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读方法。
4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。
PartⅠ. NDV抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。
二、实验仪器、材料和试剂1. 仪器5mL无菌冻存管，2.5mL和1mL注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL 吸头和移液器，温箱，离心机。
2. 材料家兔：1-2kg清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF级6-8周龄昆明鼠。
3. 试剂鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。
三、方法和步骤（一）NDV兔抗血清制备1. 家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。
家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。
拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。
正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图1）。
图1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。
兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。
使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等小动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。
图2. 家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。
固定方法是：先以四条1cm宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。
图3. 家兔手术台固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.1～0.2mL。
如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒Ulster 2C株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。
图4. 家兔耳缘静脉注射方法4. 二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。
5. 终末免疫第二次免疫后间隔2周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。
6. 试血终末免疫免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫l次后，再行检测。
7. 颈动脉放血将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部；沿颈部中线用2％普鲁卡因溶液局部麻醉，15分钟后剪开颈中部皮肤10cm长。
沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。
图5. 兔颈部血管神经分布图将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端，（图6）。
图6. 兔颈部动脉血管腹腔内注射肾上腺素1mg，以升高血压，加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集而影响取血量；先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。
用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。
（4）8. 血清分离将血液置室温中凝固约1hr，然后置4℃过夜，使血块收缩；用5mL无菌移液管吸取上层血清，转移至50 mL无菌尖底离心管中。
然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一50 mL无菌尖底离心管，在4℃下2,500g离心10分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清4℃1,500g离心10分钟，弃沉淀收集血清。
9. 抗血清保存（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入0.0l％硫柳汞或0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。
（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降。
抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。
（二）NDV鼠抗血清制备1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。
可先用右手抓住鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。
有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。
如操作时间较长，也可固定于小白鼠固定板上。
图7. 小白鼠的捉拿和固定2. 初次免疫分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。
（1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，颈部拉直，右手持注射器（5～6号针头），从耻骨联合上一侧向头端以30度角刺入腹腔（应避开膀胱）。
可先刺入皮下2～3mm，再刺入腹腔，以防药液外漏。
针头刺入部位不宜太高太深，以免刺破内脏。
注射量一般为0.1～0.25mL/10g鼠重。
图8. 小鼠腹腔注射法（2）皮下注射法：一般两人合作。
一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾；另一人左手提高背部皮肤，右手持住注射器（针头号同上），将针头刺入提起的皮下。
若一人操作，左手小指和手掌夹住鼠尾，拇指和食指提起背部皮肤，右手持注射器给药。
一般用量为0.05～0.25mL/10g鼠重。
图9. 小鼠皮下注射法（3）肌肉注射法：两人合作时，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一侧后肢，右手持注射器，注射部位多选后腿上部外侧（针头号同上）。
如一人操作，抓鼠方法类似腹腔注射，只是药液注射在肌肉内，每腿的注射量不宜超过0.1mL。
（4）尾静脉注射法：将小鼠置于待置的固定筒内，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入40℃～50℃温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。
左手拉尾，选择扩张最明显的血管；右手持注射器（4～5号针头），将针头刺入血管，缓慢给药。
如推注有阻力而且局部变白，说明针头不在血管内，应重新插入。
穿刺时宜从近为尖部1/3处静脉开始，以便重复向上移位注射。
一般用药量为0.1～0.2ml/10g，不宜超过0.5ml/10g。
图10. 鼠尾皮下注射法3. 二次免疫第一次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。
4. 终末免疫第二次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗0.2mL。
5. 试血末次注射7天后鼠眼球采血0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强l-2次后，常可使效价增高。
鼠眼球采血可采用以下两种方法：（1）眼眶后静脉丛采血：用7~10cm长的玻璃取血管，其一端内径为1—1.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将其尖端折断，使其锋利。
将取血管浸入1%肝素或其它抗凝剂溶液处理，干燥后使用。
采血时，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。
取用肝素过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。
采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。
用本法短期内可重复采血。