第四讲 放射性同位素标记物

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三、比活度:是放射性标记化台物的一个重要参 数,通常以每毫克分子所含放射性活度,即 MBq或GBq(mCi或Ci)/mmol来表示。需根据 使用要求和实验条件,合理确定标记化合物的比 活度。
对比活度的要求因使用目的而异。一般用于竞争 结合分析法测定微量物质时要求比活度高,以提 高分析方法的灵敏度。作为示踪剂用于观察某些 物质的体内过程时,则要求尽量接近生理状态下 的用量而同时具有可测量的放射性活度。
制备和使用高比活度标记物,有如下因素的限制: 一是受原料比活度和制备方法的限制;二是比活 度愈高,制备操作难度愈大;三是比活度高时, 特别是氚标记物,易引起辐射自分解,还会引起 研究对象的细胞损伤和蛋白变性,影响实验结果。
四、放射化学纯度:是放射性标记化合物质
量的重要指标,是指所需标记物的放射性占总放 射性的百分值,一般放化纯度的要求在95%以 上。
制备放射性标记化合物的基本方法
由人工核反应所制得的放射性核素,一般均为简单比 合物,如3H2、Ba14C03、Na125I等.为了得到合适的 分析试剂或示综剂,还需进一步以简单放射性化合物 为原料,制备所需的放射性标记化合物。制备标记化 合物的基本方法有同位素交换法、化学合成法、生物 合成法及热原子分反冲标记等方法。
全标记则既非均匀标记,又非定位标记,如用同位素交 换法制备氚标记化合物,往往标记物分子中所有氢原子 都可被取代,但几率各不相同,则用符号G来表示,如 G-3H-胆固醇(或3H-胆固醇(G)).
非定位标记化合物不能用于观察分子上特定基团或原子 的去向,而只是代表整个分子的代谢、分布等状况。非 定位标记可以得到较高的比活度.因为在一个分子中, 可能存在几个标记原子,且制备方法的选用面也较宽.
氯胺—T法的标记过程,以下列投料为例:
然后用透析或凝胶过滤等方法将碘标记蛋白 和放射性碘离子(125I-)分离.
氯胺—T标记中应注意的问题:
(1)氯胺—T水溶液遇光及露置空气中很不稳定,需在临用时配制; (2)氯胺—T的用量,用量过大,会明显降低标记化合物的免疫活
性和生物活性,用量不足,又将降低标记率,甚至标记不上 去等.还此原外剂,),如因果它放要射消性耗碘氯化胺物-溶T液,中故含用有量保就护需剂相(应一加般大用.Na2SO3 (3)加入氯胺—T后必须迅速混匀,以防止标记不均匀。加入氯 胺—T后反应所需时间一般在1分钟左右,但也有延至10分钟的; (4)加入偏重亚硫酸钠终止碘化反应,一般用量为氯胺—T量的 1.2—1.5倍就足够; (5)反应体积要小,使微量蛋白质保持高浓度,才能保证一定的 碘化效率; (6)pH对碘化率的影响:碘化反应的最适pH,随蛋白质的性质 而异,一般蛋白质所需pH为7.3—7.8.通常Na125I溶液中都含 有相当量的NaOH(可高达0.1M),为此,所用缓冲液必须具有 足够的缓冲容量,如常用0.2-0.5M磷酸盐缓冲液.
如果采用并非原化合物所含元素的放射性核素进行标记, 则称为非同位素标记 (Nonisotopic labeling)。如蛋 白质用131I或125I标记.所得标记物与原来化合物不完全 相同,在体内的生理、生化反应也可能不同,非同位素 标记物,只有严格控制标记方法,使其生物学行为改变 不大时,才可用作某特定物质的示踪剂.
优点:标记产品具有生物体内原有的旋光性,特别适合作生物示 踪应用,可制备一些构造复杂、化学合成难以完成或目前尚不可 能制备的有机物,如某些蛋白质、多糖、核酸、激素、生物碱及 苷类等。
全生物合成的缺点是:生成物复杂,需经过较多的分离纯化手续, 放射性原料的利用率往往较低;除非所用原料的结构已接近生成 物,否则很难标记在某一特定位置上。
酶促合成是近年来很受注意的一种标记技术,对制备一些生物活 性物质的定位标记物有一定发展前途,产品比活度也可较高,前 提是必须有特异性高的酶制剂和高比活度的底物。
放射性碘标记化合物的制备
在实验核医学及临床核医学中,放射性碘标记化 合物的应用是较早而很广泛的.碘的同位素有 29种,其中23种是放射性同位素,它们具有很 不相同的物理性质,可供不同需要时选用。
化学合成法一般都应用非标记物进 行充分的预试验(常称冷试验),以 选定最合适的制备路线及反应条件。 本法能获得高比活度、高纯度而又 是定位标记的标记化合物,这是其 他制备方法所不能同时达到的,因 此它是制备标记化合物的最主要方 法。
三、生物合成法:是利用生物(动植物或微生物)的生理代谢或
酶的生物活性,将简单的放射性物质在体内或体外转化成所需的 放射性标记物.生物合成法又可分为“全生物合成”和“酶促合 成”二类。前者常使用完整生物或某一器官的生理代谢进行生物 合成标记,后者则利用生物组织中某种特定的酶,促进合成反应。 以上二者,都是对某些放射性标记物,特别是一些构造复杂、化 学合成难以制备或目前尚不可能制备的有机化合物进行标记的有 用手段.
二、化学合成法:化学合成制备标记化合物最主要的
方法,此法基于化学合成反应的原理,利用简单的放射 性化合物作原料来制备所需的标记化合物.原则上凡能 用化学合成法合成的化合物,均可用化学合成法制备标 记化合物,其机理和方法与一般化合物合成没有本质区 别。然而,毕竟制备的是放射性核素标记物,且在标记 位置、活度、放化纯度等方面有特殊要求,因而与普通 化学合成又有许多不同处. 首先,在选用原料方面,制备标记化合物的起始原料大 多只能用简单的无机物 ; 其次,在选择合成路线时,要根据所需要的标记位置专 门设计,力求使标记原子在分子中较稳定的位置或特定 的位置上,并需考虑如何使放射性得率最高 ; 另外,制备高比活度的标记化合物,需采用微量合成及 分离纯化技术,一般需设计专门的微量合成装置,尽量 采用低温、真空技术和避免高温、高压等剧烈反应,以 减少放射性沾污 。
放射性示踪实验,是以测量放射性的踪迹来显示 该物质的行踪的,如果示踪剂中含有放射数杂质, 就会使实验结果紊乱,甚至失败。
放射性杂质不仅可以从原料及制备过程中引入, 而且也会随着标记物贮存时间的延长而逐渐产生。 因此不仅制备标记化合物时得要进行纯化分离, 而且在贮存过程中仍要密切监测它的放射化学纯 度,特别是高比活度的氚标记化合物。
应用放射性核素对化合物进行标记时应注 意的一些问题
应用放射性核素对化合物进行标记,所得放射性标记化 合物,具有与一般化合物不同的特殊性质,需要加以注 意,其要点归纳如下:
一、放射性核素的选择:选用放射性核素时,除考虑适 宜的半衰期、射线类型和能量等物理特性外,还需考虑 最好选用化合物中原有元素的同位素来标记,即同位素 标记(Isotopic Labeling).所得标记化合物的物理、化学性 质(包括分子型、旋光性等),可与原化合物基本相同.
一、同位素交换法:同位素交换是利用一种元素的 二种同位素(如x与xo)在二种不同化学状态中(如Ax与 Bx。)的互相交换来制备放射性标记化合物,即:
优点:方法较为简便.不需制备前体,无复杂的合成步
骤,待标记的化合物用量少(一般为mg级),更适用淤 标记稀有昂贵的复杂有机化合物,如反应条件选择适当, 也可获得较高放射性活度与比活度,放射性核素利用率 也可以很高。
非定位标记(Non—specific labeling):又可分为均匀标记 (Uniform labeling)和全标记(General labeling).
均匀标记是指放射性原子均匀地分布淤分子中,如用 14C02通过植物光合作用制得的14C-葡萄糖,其分子中 六个碳原子从统计学上看,被均匀地标记上14C,故可 写成14C-萄萄糖(u),或u-14C-葡萄糖.
第四讲 放射性同位素 标记化合物
概述
放射性核素标记化合物(Radionuclide
Labelled Compounds)是化合物分子中某一原子 或某些原子被放射性核素原子所取代的化合物。 放射性核素标记化合物被广泛用于医学、生物科 学研究中,是进行机体微量物质测定和示踪研究 最重要的分析试剂和示踪剂.随着应用领域的不 断深入和扩大,对放射性核素标记化合物的数量 和质量要求也愈益增高,从而也促进了放射性核 素标记技术的发展。
125I广泛用于制备分析试剂,如放射竞争分析用 的标记蛋白。125I具有二个重要优点:
一是半率期允许标记化合物的商品化及贮存应用 一段时间;
二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量 的γ射线,而无β粒子,因而辐射自分解少,标 记化合物有足够的稳定性。
通过氧化剂使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2) 与蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用(一 般是生成一碘酪氨酸,一碘化后,其反应性就大 大降低)。所以只要含有酪氨酸的化合物或人为 地接上酪氨酸基团的化合物都可用放射性碘标 记.蛋白质分子中除酪氨酸外,还有组氨酸和色 氨酸残基,有时也可生成碘化物,但它们的反应 性远不及酪氨酸。
五、标记化合物的不稳定性:放射性核素标
记化合物,除了与相应的非标记化合物具有同样 的化学、生物学等不稳定性外,更由淤分子中引 入了放射性原子,增加了不稳定因素:1)放射 性衰变引起的不稳定性;2)由放射线引起的辐 射自分解;3)由于标记位置不牢固或外界因素 的影响,引起放射性原子脱落或定位标记物中放 射性原子发生位移等造成不稳定性。
双标记及多标记(Double labeling and
multiple labeling):是指在化合物分子的不
同部位,引入一种或二种以上元素的同位 素原子或引入一种元素的两种或两种以上 同位素原子。
它们在示踪应用时,可在同一机体或离体 组织中同时观察两个指标,不仅减少工作 量,还可排除和减少由淤个体差异所引起 的实验误差.在研究化合物的不同代谢物 在代谢中的相互关系、动力学过程以及生 物反应机制等问题中,双(多)标记示踪剂 能解决一般示踪实验不易解决的问题。
影响蛋白质碘化效率的因素,主要决定于蛋白质 分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子中暴露的 程度;另一方面,碘化物的用量、反应条件(pH、 温度、反应时间等)及所用氧化剂的性质等也有 影响.
标记方法
(1)氯胺-T法:氯胺-T(Chloramine-T)是一种 温和的氧化剂,它的化学名称是:N—氯代对甲 苯磺酰胺钠盐。在水溶液中,产生次氯酸,可使 碘阴离子氧化成碘分子,反应式如下:
在发现人工核反应前,放射性核素都是从天然放 射性铀钍矿物中分离提取,由于品种不多,且特 性不适于医用,故应用有限。自从发现人工核反 应及加速器和反应堆问世以后,人们才有可能生 产许多品种的放射性核素。
目前,医用放射性核素主要通过人工核反应,从
反应堆和加速器中生产.据统计,全世界所生
产的放射性核素中,约有80%一90%用于医学。 不论用反应堆还是加速器所生产的放射性核素, 都必须经过必要的分离、纯化等放射化学处Байду номын сангаас, 经鉴定放射核纯度合格,并测定比活度后,才能 供使用.
缺点:化合物的中心原子不易用交换法标记,所以用交
换法制备标记化合物,最常用的放射性核素是氚和放射 性碘,而14C标记化合物由于反应条件要求高,就不易 用此法制备。另一方面,如果在通常条件下,即不加温、 不用特别的pH或不用催化剂等,就能交换的系统,亦 不能用于制备标记化合物,因为这样的标记物,在一般 生理条件下,标记原子亦易交换下来.另外,如一个分 子中有几个位置可以交换时,则标记位置不易有专一 性.同样,原料如含有杂质,且也含可交换位置.就会 形成放射性杂质,故应特别注意同位京素交换反应中待 标记物的纯度.
二、标记位置及命名
命名:标记化合物的命名,通常先指出标记部位,再指 出标记核素,最后列出化合物名称,三部分中以二个短 横相联接,如1-14C-醋酸.
标记位置 :由于使用放射性标记化合物的目的不同, 对放射性原子在该化合物中的标记位置也有不同的要求, 应正确选用并采用合适的制备方法。
定位标记(Specfic labeling):在研究某些代谢物质的转化途 径或反应机制一类问题时,需要追踪分子中某个基团或 某个位置上原子的去向,应将95%以上的放射性原子特 定地标记在该基团或该位置上。如1-14C-醋酸、或2 -14C-醋酸,前者表示14C标记在醋酸的羧基碳上, CH314COOH,而后者则标记在甲基碳上, 14CH3COOH.二者所能示踪的基团不同,制备二者的 合成路线也完全不同。
一般来说,放射性原子应标记在分子中牢固的、 不易脱落的位置,对淤14C、35S.13N、32P等放 射性核素,标记物位置都比较稳固,而3H在分 子中往往不稳定,即使与碳原子相连的氚,由于 邻近基团等影响,与水的交换率可以很明显,如 苯环上与羧基处于邻位或对位的氚原子及碳基α 碳上的氚原子都不稳定。
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