生物技术综合实验报告(原生质体相关)

生物技术综合实验报告（第一部分）

实验一工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌

一、实验目的

掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。

二、原理

培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。

湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液

和培养基中的微生物达到灭菌的目的。

三、器具和试剂

灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。

琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮。

四、实验内容

PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备

（一）培养基的配制步骤

1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。

2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。

3、用NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。

4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。

5、高压灭菌（121℃,15min-20min)。

6、冷却，取出，备用。

（二）棉花无菌苗培养基的制备

1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH

值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。

2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。

3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。

4、灭菌后臵于水平的工作台上冷却即可。

要求：配制1L

（三）拟南芥无菌苗培养基的制备

1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼

脂高温高压灭菌。

2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°

高压灭菌15分钟。

3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。

要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。

五、注意事项

1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量

来配制工作液、母液及培养基。

2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。

3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。

4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。

5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。

实验二无菌苗的制备

一、原理

化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。

物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。

二、实验材料、器具和试剂

棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。

0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精

三、实验内容

（一）拟南芥无菌苗培养基倒皿

1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。

2. 将上次灭菌好的9cm培养皿分开放臵超净工作台（超净工作台需先打开）上。

3. 将融化好的培养基分装于培养皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干.。（二）共培养培养基的配制

成分数量成分数量

MS大量元素(20倍）50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml) 1 ml

NH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸(1000倍) 1 ml

微量元素(100倍) 10 ml KT (0.1mg/ml) 1 ml

铁盐(100倍) 10 ml 葡萄糖30g/L

微生素(1000倍) 1 ml PH值 5.85-5.90

肌醇(100倍) 1 ml

依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。

（三）选择培养基的配制

共培养培养基+卡那霉素50mg/L + 头孢霉素400 mg/L

灭菌后，待培养基凉至60度左右加入，混匀，倒皿。

（四）棉花无菌苗的制备

1、将棉籽用手术剪刀去壳（每人3颗，饱满无病虫害种子）。

2、用0.1%的升汞灭菌13分钟。

3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。

4、28℃条件下暗培养7天（304培养箱）。

（五）拟南芥无菌苗的制备

大量法灭菌：将拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加入1ml 75%的酒精混匀1min，然后无菌水清洗4次；加入0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，

吹干，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周（304培养箱）。五、注意事项

所有操作（除数种子）均在超净工作台上进行。

六、实验结果

一周后观察无菌苗的生长状况

1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。

2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。

实验三愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化