丹参总酚酸纯化工艺研究

丹参总酚酸纯化工艺研究

摘要：目的：优化并确定丹参总酚酸大孔树脂纯化的最佳工艺。方法：以丹参酚酸B含量为考察指标，对大孔树脂纯化工艺参数进行了考察。结果：研究确定大孔吸附树脂最佳工艺条件为：选用AB-8树脂，以10倍药材量，30%乙醇作为洗脱溶媒，洗脱速度以1mL/min为宜，丹参样品上样浓度为0.5g生药/mL，吸附流速以1mL/min，最大上柱体积为60mL为宜。结论：大孔树脂吸附法是丹参总酚酸纯化工艺的有效方法。

关键词：丹参；丹参总酚酸；大孔树脂

引言

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根茎，其有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分[1]。丹参是活血化瘀的常用中药，广泛应用于治疗心血管疾病的中药复方中。水溶性丹参酚酸类是丹参的主要有效部位之一,具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等作用[2]，是治疗冠心病的主要有效成分[3-4]，其中丹酚酸B约70%。丹参水溶性成分的提取方法多采用水提醇沉法, 此方法溶剂消耗大，有效成分有明显损失。本研究采用分离效果较好的大孔树脂分离技术，对丹参总酚酸进行纯化研究。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

对照品丹参酚酸B，中国药品生物制品检定所提供；丹参购于江西省樟树中药材市场；AB-8，D101， NKA-9型大孔吸附树脂；Agilent 1200型液相色谱仪，VWD检测器，含在线真空脱气机、四元梯度泵、柱温箱；色谱数据的采集与处理由Agilent 化学工作站完成；超声波清洗仪；电子天平（十万分之一）；甲醇为分析纯和色谱纯两种，乙醇；甲酸；水为重蒸馏水等。

1.2 色谱条件与系统适应性试验

采用HPLC法测定样品中丹参酚酸B的含量。取丹参酚酸B对照品适量，精密称定，加流动相制成1mL含丹参酚酸B149.76µg的对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、12、16、20µL，注入色谱仪，按照以下方法测定：色谱柱：迪马DiamonsiLTM(钻石)C18（5 m，250×4.6mm）；流动相：甲醇－乙腈-0.4%甲酸（37∶7∶56）；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。以对照品的浓度（µg/ml，X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得到丹参酚酸B线性方程为：y=1443.8x-4.3685(r=0.9997)，线性范围为0.3744～3.744μg。该方法线性关系良好，回收率为99.89%。

2 纯化工艺研究

2.1纯化方法的比较

据文献[5]报道，醇沉法是中药水提取液常用的精制方法，但其对化学成分影响较大，近年来，随着大孔树脂吸附法的兴起，取代传统醇沉法的研究越来越多。为了确定较好的精制方法，本研究对这两种方法进行了比较，结果见表1。

（1）醇沉法

取丹参提取样品液（1g生药材·mL-1）800mL，均分为8份，每份100mL，每份相当于100g生药，加乙醇至含醇量分别为50%、60%、70%、80%，每一浓度平行各做2份。冷藏过夜，抽滤，滤液定容到500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。

（2）大孔树脂吸附法

取丹参提取样品液（1g生药材·mL-1）200mL，均分为2份，每份100mL，每份相当于100g生药，分别离心（4000r/min，15min），倒出上清液，加适量的水返溶沉淀部分，离心，合并两次离心液，上AB-8型大孔吸附树脂柱（生药量：树脂量=2：1）。待药液流尽后，加入蒸馏水洗到Molish反应为阴性，再用30%的乙醇洗脱有效成分。将洗脱液浓缩，定容至500 mL，精密吸取5 mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。

表1 不同的精制方法的比较研究

精制方法浸膏得率（%）转移率（%）纯度（%）平均（%）

大孔树脂4.30 77.50 39.22

39.40 4.36 79.42 39.59

80%醇沉12.36 64.89 11.42

11.27

12.03 61.42 11.11

70%醇沉22.88 61.89 5.89

5.91 22.93 62.50 5.93

60%醇沉30.88 83.73 5.90

5.89 30.11 81.31 5.88

50%醇沉38.95 89.92 5.02

5.01 38.45 88.36 5.00

醇沉法浸膏得率明显高于大孔树脂吸附法，且提取物中丹酚酸B的含量较低，不符合除杂精制的要求。大孔树脂吸附法对丹酚酸B保留率和醇沉法没有很大的差异，但提取物中丹酚酸B的含量将近40%，达到了实验精制的要求，故选用大孔树脂吸附法纯化精制丹参水溶性成分。

2.2大孔树脂纯化工艺参数考察与优化

2.2.1大孔树脂的预处理与再生

预处理：将大孔树脂用95%乙醇浸泡24小时，再用95%乙醇洗至与水(1：2)混合不产生浑浊，用水漂洗除去杂质并洗至无醇味，以水湿法装柱，用大量的蒸馏水冲洗后备用。

强化再生：使用过的树脂先用95%乙醇洗至流出液无色，用水洗至无醇味，再加入高于树脂层10CM的3%-5%盐酸溶液浸泡2-4小时，然后进行淋洗通柱继用3-4倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱,然后用净水洗至接近中性；再用3%-5%的氢氧化钠溶液浸泡4小时。最后淋洗通柱,用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH值为中性,备用。

2.2.2 树脂筛选

将0.5g生药/mL(丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL)样品液分别通过3种不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。树脂柱用水洗脱至洗脱液近无色，再用95%乙醇洗脱至洗脱液无色，测定洗脱液中丹酚酸B含量，将乙醇洗脱液蒸干，称重，计算回收率。结果见表2。

表2 树脂筛选结果

树脂型号

树脂用

量（g）

上样体

积(mL)

浸膏总量

(mg)

丹酚酸B

含量(mg)

吸附量酚酸B

回收率

(%)

醇洗物酚

酸B含量

(%)

药材计

(g/g)

指标成分

计(mg/g)

AB-8 14.9 27 639.75 264.17 0.91 19.72 89.93 41.29 D101 15.0 22 532.50 208.48 0.73 15.96 87.10 39.15 NKA-9 15.0 15 157.75 20.24 0.50 10.88 12.40 12.83 注：吸附量为单位干树脂吸附的总量，单位g/g或mg/g。下同。

由表2可知，在筛选的3种不同极性的大孔树脂中，用弱极性的AB-8树脂分离纯化丹参酚酸B的效能明显优于其它2种树脂，故选用AB-8树脂纯化丹参水溶性成分丹参酚酸。

2.2.3 上样浓度的确定

将不同浓度样品液分别通过AB-8树脂柱(20g干树脂)进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。结果见表3。从表3可知，上样浓度以0.5g生药/mL（丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL）为宜。

表3 上样浓度确定

上样浓度(g/mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

吸附量以药材计

(g/g)

0.83 0.84 0.86 0.92 0.95 0.87 0.77 0.76 0.72 0.65

2.2.4 吸附流速确定

将浓度为0.5g生药/mL的样品液通过AB-8树脂柱(20g干树脂)，分别以1、2和3mL/min 的流速进行动态吸附。用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。结果见表4。从表4可知，吸附流速以1mL/min为宜。