烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选

烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选杜雷;赵高岭;席宇;臧晓静;朱大恒【摘要】Using waste tobacco stem as raw material, the medium compositions and conditions of solid state fermentation for Bacillus thuringiensis HD-1 growth were optimized by orthogonal design and single factor experiments. The results showed that the optimal medium composition was: tobacco stem 88.13%,dusty yeast 1.17%,peptone1.17%,ground soybean cake 5.88%,corn flour2.93%,KH2PO40.18%,MgSO4·7H2O 0.24%, FeSO4 0.12% and MnSO4 0.18%. The best culture conditions were: inoculation concentration 6%,initial water content 65%,initial pH of the medium 7.5,under which sporulation stabilized at 9.5xl0-10CFU/g. It was feasible to produce Bacillus thuringiensis by solid state fermentation using waste tobacco stem as the main medium.%以烟草废料烟梗为培养基主要原料,采用正交和单因素试验方法,对苏云金芽孢杆菌HD-1菌株(Bacillus thuringiensis HD-1)的固态发酵培养基及培养条件进行了优化.结果表明,烟梗固态发酵培养基的最佳组合为:烟梗88.13％,酵母粉1.17％,蛋白胨1.17％,豆饼粉5.88％,玉米粉2.93％,KH2PO40.18％,MgSO4·7H2O0.24％,FeSO4 0.12％和MnSO4 0.18％；最佳培养条件为:接种量6％,初始含水率65％,初始pH7.5.在这种发酵条件下的产孢量可稳定在9.5×1010CFU/g.因此,利用烟梗废料固态发酵生产苏云金芽孢杆菌是可行的.【期刊名称】《烟草科技》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】4页(P69-72)【关键词】苏云金芽孢杆菌;固态发酵;正交设计;烟梗;产孢量【作者】杜雷;赵高岭;席宇;臧晓静;朱大恒【作者单位】郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001;郑州大学生物工程系,450001【正文语种】中文【中图分类】TS49苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上应用最为广泛的杀虫微生物，其发酵方法主要有液体深层发酵和固体浅盘发酵［1］。

目前大多数厂家使用的是液体深层发酵，但液体发酵需要昂贵的设备，浓缩和干燥耗能大，成本高，从而影响了生物农药的推广和应用。

固体发酵作为苏云金芽孢杆菌工业发酵的方法之一，与液体发酵相比在生产中逐渐体现出其优势，如废水、废渣少，环境污染少，能源消耗量低，工艺设备和技术较简单，投资低，并且产物浓度高，产品易保存，便于包装和运输［2］。

烟梗是烟草工业的副产物，我国每年约有数10万t 烟梗废弃物被弃置浪费［3］。

目前主要集中于打叶复烤厂内，不仅占用大量的仓库还需专人管理，如何对其充分利用已成为企业的迫切需求。

目前对烟梗的利用方法主要是制造梗丝和烟草薄片用于卷烟配方中，也有从烟梗中提取烟碱、茄尼醇、烟酸、果胶、植物蛋白等成分［4］的探索研究，但这些方法的利用量不大，每年仍有大量烟梗被废弃，造成自然资源的浪费。

烟梗中含有丰富的有机碳、氮和无机盐，是很好的发酵培养基质［5］。

目前用于苏云金芽孢杆菌固态发酵的原料主要是农副产品，大量生产相对成本比较高。

张怡等［6］将经处理后的废烟叶作为原料与麸皮混合作为载体，探索了固态发酵法培养苏云金芽孢杆菌的方法，但直接用烟梗为原料固态培养苏云金芽孢杆菌的研究尚未见报道。

为此，以烟梗为主要发酵原料，对培养基营养成分配比和发酵条件进行了优化，旨在探讨利用烟梗采用固态发酵法生产苏云金芽孢杆菌的可行性，以降低苏云金芽孢杆菌的生产成本，并为烟梗废料的综合利用开辟新途径。

1 材料与方法1.1 试验材料菌种：苏云金芽孢杆菌HD-1，商业菌种，本实验室保存。

烟梗由天昌国际烟草有限公司提供。

1.2 培养基斜面培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠20 g，琼脂20 g，水1000 mL；液体种子培养基：不加琼脂即可，在121℃灭菌20 min后备用。

筛选固体培养基：烟梗（粉碎过16目筛），玉米粉，豆饼粉（购于市场），蛋白胨（郑州创生），酵母粉（英国Oxoid公司），KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO4，MnSO4（天津市科密欧化学试剂开发中心）。

1.3 培养基成分的优化设计碳、氮源配比的优化：以烟梗为主要碳源，以蛋白胨、酵母粉、豆饼粉和玉米粉为补充氮源［7］，每个因素选高低4个水平进行正交试验设计［8］，应用L16（45）正交表对各组分进行优化试验，考察不同培养基组分对活芽孢数的影响。

各因素水平见表1。

无机盐优化：确定好碳、氮源配比后，将KH2PO4，FeSO4，（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O 4个因素作为培养基无机盐成分，每个因素选3个水平设计正交试验，应用L9（34）正交表对无机盐组分进行优化试验。

各因素水平见表2。

表1 培养基的碳、氮源正交试验水平Tab.1 Level of carbon and nitrogenresourcein medium（g）水平豆饼粉酵母粉0 0.2 0.4 0.6烟草废料10.0 12.5 15.0 17.5蛋白胨0 0.1 0.2 0.4 1 2 3 4 0 1 2 4玉米粉0 0.2 0.5 1表2 培养基的无机盐正交试验水平Tab.2 Level of inorganic saltin medium （g）水平1 2 3 KH2PO4 0.01 0.03 0.06 FeSO4 0.01 0.02 0.04 MnSO4 0.015 0.030.06 MgSO4·7H2O 0.02 0.04 0.061.4 三角瓶发酵培养按照正交试验设计，将各种配比的培养基配置好后装入250 mL的三角瓶，加水后摇匀，灭菌接种后培养。

培养过程中培养条件先按初始含水率60%，接种量5%，初始pH7.0，放入30℃培养箱培养，定时翻动摇匀培养基，并取样涂片、染色观察，至芽孢脱落率达到30%时终止培养，测其活芽孢数。

1.5 培养基条件的优化设计确定最优培养基营养成分组合后，用单因素试验方法，分别对接种量，培养基的初始pH，初始含水率进行优化。

1.6 分析方法采用孔雀绿及沙黄染色法观察芽孢的形成，平板菌计数法［9］对固体培养芽孢计数。

2 结果与讨论2.1 碳、氮源的优化结果根据表l正交试验设计对HD-1菌株进行固体发酵，结果表明（表3）：由极差R 可以看出，各因素对产孢量的影响为：烟草废料＞酵母粉＞玉米粉＞豆饼粉＞蛋白胨；烟梗固态发酵培养基的最佳组合为：烟梗15 g，酵母粉0.2 g，蛋白胨0.2 g，黄豆饼粉1 g，玉米粉0.5 g。

烟梗为菌体生长提供碳源，又是菌体生长的载体，且其含有丰富的糖类，很适宜作为发酵材料。

由表3可以看出，以蛋白胨为氮源对产芽孢数量影响不大，但以酵母粉、豆饼粉、玉米粉为补充氮源时影响较大，它们与烟梗混合，大大改善了培养基的发酵性能，提高了芽孢产率。

表3 L16（45）碳氮源优化正交试验设计与结果Tab.3 Designandresulto for thogonal test for optimizingcarbonandnitrogenresource注：①K为各因素水平产芽孢量的平均值；②R为极差；下同。

酵母粉蛋白胨豆饼粉玉米粉烟梗g 10 10 10 10 12.5 12.5 12.5 12.5 15 15 15 15 17.5 17.5 17.5 17.5 4.623 6.082 6.790 4.918 2.167 g0 g0 g0 0.2 0.5 11 0.5 0.2 0 0.2 01序号1234567891 0 0.5 0.5 10 11 12 13 14 15 16 g0124240142101042芽孢数/×1010CFU/g 2.33 6.83 5.33 4.00 5.00 7.17 6.33 5.83 6.00 6.50 7.83 6.83 5.50 6.00 3.50 4.67K1①K2K3K4 R②0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0 0.2 0.4 0.6 4.707 6.625 5.748 5.332 1.918 0.1 0.2 0.4 0.1 0 0.4 0.2 0.2 0.4 0 0.1 0.4 0.2 0.1 0 5.500 5.540 5.790 5.582 0.290 5.373 6.498 5.375 5.168 1.330 0.2 4.5405.9576.207 5.707 1.6672.2 无机盐优化试验在菌体的生长中，许多矿质元素都直接参与细胞的组成、能量的转移、维持原生质的胶质体系和渗透性，对生长起着重要的作用。

其中Mg2+，Mn2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+的适当浓度对营养细胞的生长、芽孢和伴孢晶体的形成有明显刺激作用［8］。

由表4可以看出，KH2PO4的影响最显著，其次是MgSO4·7H2O，MnSO4和FeSO4的影响较小。

最佳无机盐配比为KH2PO40.03 g，FeSO40.02 g，MnSO40.03 g和MgSO4·7H2O 0.04 g。

2.3 接种量对芽孢形成的影响接种量是与培养基利用率直接相关的参数。

接种量大时尽管可以使芽孢生长快、周期短，但后期可能因缺乏营养而无法达到较高的芽孢数；而接种量太小时不仅对营养利用不充分，且发酵周期可能延长，染菌几率提高［10］。

在确定最佳培养基组成成分后，将其接种量设为4%，5%，6%，7%和8%5个因素水平进行试验，结果见图1。