PCR检测技术 PPT
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pcr技术课件
数据处理
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
对实验数据进行统计分析，如计算Ct值、分析扩增效率等。
04
pcr技术的优化和注意事项
优化pcr反应条件
01
02
03
温度循环
优化pcr反应的变性、退 火、延伸等温度循环，以 提高扩增效率和特异性。
镁离子浓度
调整镁离子浓度，以获得 最佳的pcr扩增效果，镁 离子浓度过高或过低都可 能影响扩增效率。
02
pcr技术的基本原理
核酸的复制
核酸是生物体的遗传物质，负 责携带和传递遗传信息。
在细胞内，核酸通过复制传递 遗传信息，确保遗传信息的稳 定性和连续性。
核酸复制过程中，DNA双链解 开，以母链为模板，r技术基于核酸的复制原理， 通过特定的引物和耐高温的DNA 聚合酶，在体外实现核酸的快速
数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，但设备成本较高；实时PCR技术具有操作简便和 成本较低的优点，但在灵敏度和特异性方面可能略逊于数字PCR技术。
pcr与其他技术的结合
pcr技术与测序技术的结 合
通过将PCR技术和测序技术相结合，可以实 现高通量、高精度的核酸分子检测和分析， 有助于深入研究和理解基因组学和转录组学 等领域。
pcr技术的应用领域
遗传病诊断
通过检测特定基因的突变，对遗传病 进行早期诊断和产前诊断。
微生物检测
用于检测和鉴定细菌、病毒和其他微 生物，在食品安全、环境保护和疾病 控制等领域有广泛应用。
古生物学和考古学
用于分析古代生物遗骸的DNA，研 究物种进化和人类起源。
法医学
用于鉴定个体身份、亲子关系和生物 样本的来源，在犯罪调查和法庭科学 中具有重要应用价值。
扩增。
pcr反应体系中包含模板DNA、 引物、dNTPs和耐高温的DNA聚
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR技术在医学检验中应用PPT
PCR技术在医学检验中应 用
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
PCR检测技术ppt课件
.
变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为 新一轮循环的模板，经过25~40个循环后DNA可
.
三、PCR的基本操作 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析
.
PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
.
半保留复制
.
2、三个基本的步骤循环
①变性 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原 则互补结合，也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要 的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
开离心管时动作要轻，以防管内液体 溅出。
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
.
核酸提取方法
PCR技术原理与操作PPT
PCR步骤
PCR技术进行时的实验步骤及关键点。
1 准备反应体系
准确配制反应体系，对反应结果有决定性的 影响。
2 初始变性
94℃高温变性DNA，断与模板DNA结合，为复制DNA段提供模板。
中温度下，聚合酶按照引物模板，从5' 到 3' 延长新DNA链。
PCR反应体系与条件
PCR反应体系和条件对PCR反应质量的影响及优化方法。
反应体系
PCR反应液的主要成分是DNA模 板、引物、酶和缓冲剂等。
反应条件
包括温度、时间、酶的用量，不 同反应条件对反应结果有着明显 的影响。
优化方法
PCR后期的处理包括电泳分析、 测序等，也是PCR发现和应用的 重要方面。
PCR应用领域
PCR技术最新的应用案例及特点和优势。
1
鉴定GMO
利用PCR技术提供检测和确定转基因技术应用在食品中的程度和情况。
2
疫情监测
PCR技术在病原体检测、疫情监测等方面有广泛应用。
3
医学诊断
PCR技术已成为临床医学检测中最敏感的检测技术之一，成为诸多疾病的确诊手段。
PCR技术发展和创新
PCR技术的发展历程及当今应用的新技术和新方法。
蓝光PCR技术
利用DNA和RNA在紫外光和 蓝光照射下的发光原理进行 检测。
实时荧光定量PCR技术
将定量PCR与荧光检测技术 相结合，能够准确快速地检 测样本中的目标序列。
数字PCR技术
将PCR反应分隔为大量微小 空间进行，可有效减少标准 曲线算法的误差和PCR非特 异性增长的影响。
PCR技术的优缺点和局限性
无处不在
在病毒、遗传疾病的诊断和育种等领域都有广泛应用。
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
PCR技术详解ppt课件
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间 的非特异性结合，提高PCR反应的特异性
28
③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 • 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
22
低浓度引物
高浓度引物
23
3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多 重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的 存在或缺失。
引物
电 泳
24
4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量 功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一 轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓 度
3
• 1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人 发明了聚合酶链反应（PCR） • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错，未能推广 • 1988 年 ， Saiki 等 人 从 嗜 热 杆 菌 (thermus aquaticus) 中 提 出 TaqDNA 聚 合 酶 ， 使 得 PCR技术得以广泛应用 • 1993 年， Mullis 等因此项技术获诺贝尔化 学奖
15
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR详细讲解PPT课件
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
2021/3/7
CHENLI
22
2021/3/7
普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
32
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
2021/3/7
CHENLI
36
引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
2021/3/7
CHENLI
37
Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
2021/3/7
CHENLI
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
2021/3/7
CHENLI
22
2021/3/7
普通PCR仪
CHENLI
温度梯度PCR仪
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
CHENLI
32
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
2021/3/7
CHENLI
36
引物设计的基本原则
10、引物3’端要避开密码子的第3位。
如扩增序列位于基因编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与 效率。
2021/3/7
CHENLI
37
Real-Time PCR引物设计原则
1、避免重复碱基，尤其是G。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
由于延伸是从3’端开始的，所以不能进 行任何修饰。
2021/3/7
CHENLI
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
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5
大家好
变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为 新一轮循环的模板，经 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析 7
大家好
PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
16
大家好
四、实时荧光PCR技术
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
17
大家好
三个基本概念
1、扩增曲线 2、荧光阈值 3、Ct值
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）； 纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集
3
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
大家好
半保留复制
4
大家好
2、三个基本的步骤循环
①变性 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原 则互补结合，也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要 的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
8
大家好
505 PCR配制室
该实验区主要进行的操作为贮存试 剂的制备、试剂的分装和主反应混合 液的制备。
试剂和用于标本制作的材料应直接 运送至该区，不得经过其他区域。
9
大家好
506 标本处理室
主要进行的操作为临床标本的保 存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存 及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA的合成。
开离心管时动作要轻，以防管内液体 溅出。
20
大家好
结束
21
1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
10
大家好
核酸提取方法
1、离心柱法
离心柱法全自动核酸提取仪采用离 心机和自动移液装置想结合的方法
13
大家好
PCR仪
14
大家好 15
大家好
508 PCR扩增产物分析室
主要进行的操作为扩增片段的测定。
1、最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服 将扩增产物带出。 2、本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、 甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。 3、本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可 能性。
11
大家好
2、磁珠法
12
大家好
607 PCR扩增室
该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩 增及实时荧光PCR仪的结果判读。此外，已 制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制 备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和 制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进 行。
1、不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 2、为避免气溶胶所致的污染，尽量减少走动。
18
大家好
PCR污染与对策
污染原因
1、PCR扩增产物污染 ——最主要最常见的污 染问题。
2、标本间交叉污染——主要由于盛装标本的 容器被污染 、加样枪污染导致标本间污染 、 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩 散，导致彼此间的污染 。
19
大家好
防止污染的方法
1、合理分隔实验室 2、分装PCR试剂 3、防加样枪引起污染 4、避免样本外溢及外来核酸的进入，打
大家好
PCR检测技术
1
大家好
一、PCR的定义
PCR聚合酶链式反应，又称休外DNA扩增技 术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA 片段的技术。
2
大家好
二、PCR技术的基本原理
1、 PCR原理
用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段， 类似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5’末端和3’末端互补的寡苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制 的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成， 重复这一过程，即可目的DNA片段得到扩增
大家好
变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为 新一轮循环的模板，经 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析 7
大家好
PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
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四、实时荧光PCR技术
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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大家好
三个基本概念
1、扩增曲线 2、荧光阈值 3、Ct值
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）； 纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集
3
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
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半保留复制
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2、三个基本的步骤循环
①变性 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原 则互补结合，也存在两条模板链之间的结合， 但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要 的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
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大家好
505 PCR配制室
该实验区主要进行的操作为贮存试 剂的制备、试剂的分装和主反应混合 液的制备。
试剂和用于标本制作的材料应直接 运送至该区，不得经过其他区域。
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大家好
506 标本处理室
主要进行的操作为临床标本的保 存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存 及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA的合成。
开离心管时动作要轻，以防管内液体 溅出。
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大家好
结束
21
1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
10
大家好
核酸提取方法
1、离心柱法
离心柱法全自动核酸提取仪采用离 心机和自动移液装置想结合的方法
13
大家好
PCR仪
14
大家好 15
大家好
508 PCR扩增产物分析室
主要进行的操作为扩增片段的测定。
1、最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服 将扩增产物带出。 2、本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、 甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。 3、本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可 能性。
11
大家好
2、磁珠法
12
大家好
607 PCR扩增室
该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩 增及实时荧光PCR仪的结果判读。此外，已 制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制 备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和 制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进 行。
1、不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 2、为避免气溶胶所致的污染，尽量减少走动。
18
大家好
PCR污染与对策
污染原因
1、PCR扩增产物污染 ——最主要最常见的污 染问题。
2、标本间交叉污染——主要由于盛装标本的 容器被污染 、加样枪污染导致标本间污染 、 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩 散，导致彼此间的污染 。
19
大家好
防止污染的方法
1、合理分隔实验室 2、分装PCR试剂 3、防加样枪引起污染 4、避免样本外溢及外来核酸的进入，打
大家好
PCR检测技术
1
大家好
一、PCR的定义
PCR聚合酶链式反应，又称休外DNA扩增技 术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA 片段的技术。
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大家好
二、PCR技术的基本原理
1、 PCR原理
用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段， 类似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5’末端和3’末端互补的寡苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制 的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成， 重复这一过程，即可目的DNA片段得到扩增