免疫组化操作步骤
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化步骤
免疫组化步骤：
1.烘片：60度，20Min
2.水化：二甲苯10min –二甲苯10min—无水乙醇5min---95%乙
醇5min---75%乙醇5min-PBS 5min
3.消除内源过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗
3X5min
4.抗原修复：水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃
左右，加沸石。
放入组织芯片加热10-15分钟, 自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5.封闭：正常羊血清工作液封闭，37℃20 min
6.一抗：4度过夜
7.清洗：PBS 3X5min
8.二抗(HRP)：37℃孵育1h, PBS冲洗3X5min
9.AEC/DAB显色，显微镜下观察染色情况。
自来水冲洗终止
10.苏木素复染2Min （时间要摸索）
11.盐酸酒精分化（0.5ml ~1ml浓盐酸+ 75%酒精99ml）10秒
12.自来水冲洗10min
13.75%乙醇5Min-95%乙醇5min –无水乙醇5min-二甲苯5min
14.甘油封片。
免疫组化实验步骤
1.PBS冲洗5min×3次
2.加修复液，低温加热10min/高温2min
3.室温冷却10min
4.PBS冲洗5min×3次，用滤纸吸干PBS
5.滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），湿盒内室温孵育15min
6.一抗稀释
预实验：Anti-MGMT 1:100 1:200 1:400
Anti-XRCC1 1:100 1:200 1:400
Anti-P53 1:50 1:100 1:200
正式试验：Anti- MGMT 1:400
Anti-XRCC1 1:400
Anti- P53 1:100
7.滴加上述稀释好的一抗，4℃过夜
8.滴加二抗试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育20min
9.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
10.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育20min
11.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
12.DBA显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液。
13.自来水冲洗10min
14.苏木素复染
15.自来充分水冲洗，蒸馏水浸泡2min
16.酒精梯度脱水3min×7次
17.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
18.树胶封片，80℃烤箱烤干。
HE染色
1.苏木素染色10min，自来水充分冲洗。
2.伊红染色2min，自来水充分冲洗
3.酒精梯度脱水3min×7次
4.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
5.树胶封片，80℃烤箱烤干。
免疫组化基本步骤
免疫组化基本步骤
免疫组化是一种在组织中检测特定蛋白质表达的方法，以下是免疫组化的基本步骤：
1. 取得组织样本：从活体或已固定的组织中，取出薄片状的组织样本。
可以使用福尔马林或其他固定剂来固定组织。
2. 去除蜡块：如果组织样本是固定在蜡块中，需要将薄片状的组织样本从蜡块中剥离。
可以使用刮片或其他工具进行此步骤。
3. 抗原恢复：组织样本经过固定处理后，抗原的结构可能会发生变化，影响抗原的免疫反应性。
因此，需要进行抗原恢复步骤。
抗原恢复的方法包括热处理、酶消化、酸碱处理等。
4. 抗体染色：选择适当的一抗体来检测目标抗原。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且应该针对目标抗原具有高度的特异性。
一抗可以标记有荧光染料、酶、金标或其他物质。
5. 二抗染色：将与一抗起反应的二抗添加到组织样本中。
二抗可以与一抗结合并形成复合物，用于增强抗原的检测信号。
6. 可视化：根据二抗的标记物不同，可以使用荧光显微镜、酶标仪或其他工具来可视化抗原的表达情况。
荧光染料会发出荧光信号，而酶标记会产生染色反应。
7. 图像分析：对可视化的图像进行分析，可以使用计算机软件自动计算或手动计数标记的细胞或组织区域。
以上是免疫组化的基本步骤，但具体的操作方法可能会根据实验的具体要求而有所不同。
免疫组化步骤总结
免疫组化步骤总结免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定分子在组织和细胞中的表达情况。
本文将对免疫组化的步骤进行总结，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
免疫组化步骤主要包括样本制备、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、信号放大、显色与染色、显微镜观察和结果分析等环节。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
1. 样本制备：首先，需要选择合适的组织样本或细胞，可以通过切片、细胞培养等方法获得。
然后，将样本固定在载玻片上，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
固定后，需要进行脱水和透明化处理，使样本适合于免疫组化的进一步步骤。
2. 抗原修复：有些抗原在固定和加工过程中可能会丧失免疫反应性，需要进行抗原修复。
常用的方法有热处理、酶解等，目的是使抗原恢复其免疫原性，提高抗体的特异性和敏感性。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、牛血清、小鼠血清等，进行预处理，将其涂覆在样本上，阻断不特异性结合位点。
4. 一抗孵育：将特异性抗体（一抗）与样本接触，孵育一定的时间，使抗体与靶分子发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求和抗体的特异性来确定。
5. 二抗孵育：一抗与抗原结合后，需要加入与一抗来源物种不同的二抗。
二抗是与一抗来源物种的免疫球蛋白发生反应的抗体。
二抗可以标记有荧光物质、酶物质等，以便于后续的信号放大和显色。
二抗的选择要根据一抗的来源物种和实验需要来确定。
6. 信号放大：为了增强免疫反应的信号，可以使用一些信号放大的技术。
常用的信号放大方法有生物素-链霉亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法可以使目标物质的信号增强，提高实验的灵敏度和准确性。
7. 显色与染色：信号放大后，需要进行显色与染色步骤。
这一步骤可以根据实验需要选择适当的染色剂，如荧光染料、酶标记物等。
免疫组化操作步骤(自编)
免疫组化操作步骤一免疫组化（LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2.缓冲液洗 3min/2 次。
3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4.缓冲液洗 5min/2 次。
5.滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6.缓冲液洗 5min/2 次。
7.滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8.缓冲液洗5min/2 次。
9．滴加Primary Antibody Enhancer（增强子） , 在室温下孵育20 分钟。
10．缓冲液洗5min/2 次。
11．滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30 分钟。
（注：HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12．缓冲液洗5min/2 次。
13．向1ml DAB Plus Substrate （或AEC Plus Substrate）中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）, 混匀后滴加到切片上，孵育3 －15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14．自来水充分冲洗, 复染，脱水, 透明, 封片。
二．免疫组化（三步法）操作步骤：（1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（2 ）、3%H 2 O 2 室温孵育5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3 ）、蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 分钟x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（4 ）、5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育10 分钟，倾去血清，勿洗。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
免疫组化步骤
免疫组化步骤
1，拷片：在烘干器拷片25-30分钟，温度设置为50摄氏度。
2，脱蜡：二甲苯Ⅰ液10min，二甲苯Ⅱ液10min。
3，复水：100％乙醇Ⅰ液5min，100％乙醇Ⅱ液10min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min
4，PBS清洗3次，每次5min。
5，抗原修复：将枸橼酸放入沸腾的高压锅里预热2min，枸橼酸液沸腾后将切片浸入，盖锅盖，在高压锅内加热至沸腾（98℃-100℃），5分钟，取出冷却至室温；6，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
7，在湿盒内滴加3％内源H2O2酶，室温10min；
8，PBS洗涤3次，每次5min
9，封闭，湿盒内滴加5％BSA，室温下15-20min，甩去多余液体；
10，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；（如在4摄氏度内过夜需要提前在37摄氏度水浴箱内复温30min。
）
11，PBS洗涤3次，每次5min；
12，滴加二抗，湿盒放于37℃水浴锅内，1h；
13，PBS洗涤3次，每次5min；
14，滴加DAB显色，37℃，10min；
15，PBS洗涤3次，每次5min；
16，苏木素复染2min，自来水冲洗；（如苏木素颜色过深，进行分化）
17，脱水：70％乙醇5min，80％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇Ⅰ5min，100％乙醇Ⅱ。
18，透明二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ10min。
19，树胶封片，镜检。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。
免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。
以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。
-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。
2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。
常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。
3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。
因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。
4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。
6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。
二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。
7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。
8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。
9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。
然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。
10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。
可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。
此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。
免疫组化步骤
步法免疫组化实验步骤详解: 1•脱蜡：脱蜡要达到将原组织玻片上的石蜡充分脱掉的目的，加热只是为了加速石蜡的溶解；
二甲苯1（15min 60 度）--二甲苯15min 60 度）--100% 乙醇
（10min）--90% 乙醇（5min） --80%乙醇（5min）--70% 乙醇（5min）--
蒸馏水（5min）
2•抗原修复（微波修复法）：目的是让蛋白抗原充分暴露
1）柠檬酸盐溶液：（PH: 6.0） 500ml不同的蛋白应采用不同的抗原修复条件，比如说膜蛋白PDGFRA的煮沸时间不能过长；核蛋白KI67 及包浆蛋白应充分煮沸；
2）E DTA修复液（PH: 9.0）稀释后体积是 500ml cox2 及 PDGFRA!
白的抗原修复的效果较好；
3.清洗：PBS 5min*3 次；
4.去除组织 H2O2 酶：3%H2O2 37 度 10min ；
5.清洗：PBS 5min*3 次；
6•—抗孵育：4度过夜；
过夜--过夜--过夜--过夜--过夜
7•取出玻片盒，放置于室温复温 30min （—般不做此步骤）；
8•—抗回收：将一抗回收标记清楚以备进行其他实验；
9.清洗：PBS 5min*3 次；
10•孵育二抗：37度30min ；二抗的添加主要是根据一抗的来源，抗
鼠、抗兔或者其他；
11.清洗： PBS 5min*3 次
12.DAB显色：DAB的显色时间主要取决于棕色颗粒的数目和浓度; 一般在3min-10min之间；
13•复染：用苏木精染色，根据显微镜下核的深度来判断；
14.蓝化：将染过的核放在水中10min左右；
15透明、封片：蓝化后的玻璃切片滴加中性树脂透明后封片；16•放置于65度烤箱，烘干，观察实验结果。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的组织学检测方法，通过使用特异性抗体标记目标蛋白的方法，来检测该蛋白在组织中的存在和分布情况。
以下是免疫组化的一般步骤：第一步：固定组织样本首先，将需要检测的组织样本进行固定处理，通常使用的固定剂是10%中性缓冲福尔马林（neutral buffered formalin，NBF）。
组织固定可以保持细胞和组织的形态结构，防止其在处理过程中的破坏。
第二步：脱水和石蜡浸渍固定后的组织样本需要经过脱水和石蜡浸渍处理，以便能够在切片时保持其形态。
首先使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，然后将组织样本置于融化的石蜡中，使其充分浸渍。
脱水和石蜡浸渍的目的是将组织中的水分替换成石蜡，以便在切片时能够获得高质量的组织切片。
第三步：制备组织切片在将组织样本进行脱水和石蜡浸渍后，使用组织切片机将组织样本切成薄片。
通常使用的厚度为4-6微米的切片。
制备组织切片时需要注意保持切片的完整性和减少组织切片之间的花样。
第四步：脱蜡和再脱水经过组织切片制备后，需要进行脱蜡和再脱水处理，以便后续的免疫染色。
脱蜡处理通常使用木油（xylene）或等效溶剂来去除石蜡，并进行再脱水步骤以去除木油。
第五步：抗原修复抗原修复是免疫组化中非常重要的一步。
组织固定和石蜡包埋可以对目标蛋白的抗原性造成一定的损害，抗原修复通过将切片置于酶解剂（如胰蛋白酶）或缓冲盐溶液中加热，修复抗原，使其更易于抗体识别。
第六步：阻断非特异性结合第七步：抗体孵育在进行免疫染色之前，需要将特异性抗体添加到切片上，与目标蛋白结合。
免疫组化可以使用多种抗体，包括一抗（primary antibody）和二抗（secondary antibody）。
一抗是与目标蛋白直接结合的抗体，而二抗则与一抗结合，其本身标记有酶标记物，如辣根过氧化物酶，或荧光标记物。
第八步：信号可视化和显色完成抗体孵育后，需要使用适当的显色试剂将抗体信号可视化。
显色试剂可以是一些酶标颜色反应法，例如使用DAB（3,3'-联氨基苯并噻唑啉-4,5′-二羧酸）进行显色；或者是荧光探测试剂，通过激光共聚焦显微镜或荧光显微镜来观察。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋)、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70%酒精20min 80%酒精1h90％酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后,在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸,在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖)，将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中,盖上锅盖,待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数）,4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次,除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物,室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB(二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟,显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0.1％HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明:70％酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。
免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。
下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。
1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。
一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。
-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。
-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。
例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。
2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。
一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。
-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。
-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。
可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。
3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。
根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。
-荧光标记：如荧光素等。
-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
-金标记：如胶体金、纳米金等。
4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。
一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。
根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。
-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。
-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。
-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。
5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。
根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。
-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。
-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。
它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。
以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。
2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。
3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。
4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。
脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。
2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。
抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。
2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。
阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。
一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。
一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。
2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。
4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。
5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。
洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。
可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。
免疫组化步骤
免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20-25min；2、脱蜡：二甲苯i、ii、iii，3次，5min/次；注意：从烤箱中取出，迅速放入二甲苯中，防止蜡凝结；3、复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精---70%酒精——50%酒精，5分钟/次；4.用DDH 2O清洗两次，5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新mvs-0100），125℃，5分钟注：1x修复液：198mlddh2o+2ml抗原修复液100x,混匀；抗原修复压力锅的使用：确认垫片和传热片的放置，加入700mLDH2O，放入铁架固定片盒，小心不要按压传热片，盖上锅盖，检查排气喷嘴是否能自由旋转，将锅盖上的“关闭”对准白点，并且在“开放”和边缘之间没有间隙，设置程序并启动；之后，等待排气口的红色指示消失，然后打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xpbs洗2次，5min/次；7、去除h202酶：3%h202，15min；注意遮光；注：用1xpbs将30%H202稀释至3%H20（例如5ml 30%H202+45ml 2PBS00ml 3%H202）8、pbs2次，pbst1次，5min/次；9.堵塞：先将薄膜擦干，注意保持组织湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室加热1小时，湿盒；不要使用过多的密封液，以免溢出；注：封闭液：1xpbs，0.3%tritonx-100，10%goatserum（如：870ulpbs+30ul10%tritonx-100+100ul10%goatserum1ml封闭液）；10.一抗孵育：用封闭液稀释一抗。
不同抗体的稀释倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。
对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：gfap--1:200，ki67--1:200，CD31-1:20~1:40，flag-1:200，nestin-1:200，III微管蛋白-1:100011，室温，30min；（从冰箱中取出时要慢慢移动）12。
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免疫组化操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.
免疫组化操作流程试剂准备
1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl
2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
即抗原修复液
3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST
4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。
操作流程
免疫组织化学染色
SP法：
1. 脱蜡、水化：
脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。
从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；
无水乙醇中浸泡3分钟；
95%乙醇中浸泡3分钟；
70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；
50%乙醇中浸泡3分钟；
自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡
2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）
高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。
电磁炉1000W 2min。
3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略
4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。
5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的
H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。
目的为阻断内源性过氧化物酶)；
6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)
7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。
用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。
8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。
4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
）。
9. PBST洗3次各3分钟；
10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥的超敏二步法免疫组化检测试剂。
11. PBST洗3次各3分钟；
12. DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。
13. PBST或自来水冲洗10分钟；
14. 苏木精复染20秒，自来水分化；
15.自来水冲洗30分钟；
16. 酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。