免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.

免疫组化操作流程试剂准备

1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl

2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液

3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST

4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。

操作流程

免疫组织化学染色

SP法：

1. 脱蜡、水化：

脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。

从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；

无水乙醇中浸泡3分钟；

95%乙醇中浸泡3分钟；

70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；

50%乙醇中浸泡3分钟；

自来水中浸泡3分钟；

梯度脱蜡

2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）

高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。

3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略

4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。

5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的

H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)；

6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)

7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。

8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。

9. PBST洗3次各3分钟；

10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥的超敏二步法免疫组化检测试剂。

11. PBST洗3次各3分钟；

12. DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。

13. PBST或自来水冲洗10分钟；

14. 苏木精复染20秒，自来水分化；

15.自来水冲洗30分钟；

16. 酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。