第六章蛋白质的分离纯化和表征
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蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定
蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定蛋白质是一个关键的生物分子，是所有生命活动的重要组成部分。
它们由氨基酸组成，在细胞内负责许多生物功能，如构建细胞结构、代谢、信号传递和基因表达调节。
正因为如此，对蛋白质复合物的研究和分析，对于广泛的生物医学领域都有着极其重要的意义。
蛋白质复合物是由两个或多个蛋白质相互结合而成的复合物。
在生物系统中，不同的蛋白质通过相互作用或结合形成复合物，然后再与其他生物大分子分子（如核酸，碳水化合物等）进一步相互作用。
因此，蛋白质复合物的功能相对于单独的蛋白质单元，具有更高的特异性和活性。
然而，要研究和分析这种复杂的物质，需要提取、分离、纯化和鉴定它们的化学结构。
这里我们来介绍蛋白质复合物的分离纯化及结构鉴定方法。
蛋白质复合物分离纯化的方法分离纯化蛋白质复合物需要采取一系列方法，这些方法包括离心、柱层析、电泳、质谱等。
这些方法不仅能对蛋白复合物进行有效的分离纯化，而且能够提供关于蛋白复合物结构和功能的详细信息。
离心离心是利用重力作用将不同大小的颗粒分离开的一种方法。
这个原理也可以用于分离不同大小的蛋白质复合物。
采取极高速度离心的形式，离心能够快速分离出高度纯化的复合物，以便进行后续分析。
然而，该方法的限制在于它仅能分离基于大小差异的蛋白质复合物。
柱层析柱层析是一种利用化学性质或大小/形状差异区分蛋白质的方法。
常用的柱层析包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析和尺寸排斥层析等。
其中凝胶层析是一种分离蛋白质的最常用方法。
它是通过将样品在列有多种聚合物（如凝胶、聚丙烯酰胺等）的柱上运行，使蛋白质基于他们的大小差异，以一定的速率向下流动，根据质量、形状、电荷或亲和力进行分离。
电泳电泳是一种通过在电场中将分子带动移动，根据它们的电荷和分子重量分开的方法。
离子电泳和凝胶电泳是最常用的两种电泳方法。
离子电泳利用离子的运动在不同的pH值下移动的速度承载的差异来分离分子。
凝胶电泳则是将样品分离到高聚合物凝胶上，并使用电场将它们从凝胶带到电极上的一种分离方法。
蛋白质的分离纯化和表征
2.盐溶和盐析
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的通性、纯化和表征
加入样品，待分离物与配基结合 吸附在载体表面，其它分子不被 吸附而流出柱外
用自由配基分子洗脱，蛋白质 从柱上洗脱下来（亲和洗脱） 返回
氮川三乙酸镍（Ni-NTA） 金属亲和层析
Spacer arm ligand His6 tag
样品的浓缩、干燥和保存
常用的浓缩方法：
蒸发浓缩（如空气流动蒸发浓缩 ）
第五节
蛋白质的通性、纯化和表征
一、蛋白质的通性
（一）蛋白质的酸碱性质
蛋白质是两性电解质。 可解离集团主要来自侧链上的功能团。
蛋白质的等电点（一般在4.6-6.7之间）
应用：
利用蛋白质在pI溶解度最小 --- pI沉淀法 利用各种蛋白质pI不同 --- 电泳法、离子交换层析法
Table1-4
Tyr及蛋白质定性
二、蛋白质的分离提纯
选材
一般原则
前处理 粗分级 细分级
层析 盐析 等电点沉淀 有机溶剂分级沉淀 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析
电泳
脱盐、浓缩、干燥和保存
选材：
生物原料：植物、动物器官与组织、微生物。
选择生物原料的原则：
富含所要纯化的蛋白质、 容易获取与处理
前处理
机械方法：研磨法、组织捣碎法、匀浆器破碎法
f / f0＝1.0 f / f0 1.0 分子近球形 分子不对称，值越大，不对称程度越高
（三）蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀
1. 蛋白质是亲水胶体（hydrophilic colloid） 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 2. 蛋白质的 体的稳定性而使其沉淀。
沉淀法（如盐析法）
超滤法 吸收法（实验室中最常用的吸收剂有 聚乙二醇、蔗糖、甘油等 ）
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质分离纯化和表征优秀课件
2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
蛋白质的分离纯化和表征
现在十二页，总共二十五页。
沉淀方法
*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化 钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以 及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
*有机溶剂深沉法 如乙醇,丙酮等沉淀。
现在十三页，总共二十五页。
*重金属盐沉淀法析 金属离子 *生物碱试剂和某些酸类沉淀法析 生物碱 *加热变性沉淀法析 加热
现在十四页，总共二十五页。
四 蛋白质分离纯化的一般原则
前处理 组分级处理 细分级处理
现在十五页，总共二十五页。
五 蛋白质分离纯化的方法
根据分子大小不同 透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤 根据溶解度差别
等电点沉淀、PH控制、蛋白质盐溶和盐析、有机溶剂
、温度 根据电荷不同 电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦
(五) 凝胶过滤法测定相对分子质量
现在七页，总共二十五页。
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定
蛋白质分子质量
每两个氨基酸残基结合一SDS分子 后果：
1 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差 别。
2 改变了蛋白质单体分子的构象。 公式：
现在八页，总共二十五页。
形状
X射线晶体结构分析
现在九页，总共二十五页。
三 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一)胶体性质
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万 至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为 胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷
水化膜
现在十页，总共二十五页。
水化膜
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
沉淀方法
*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化 钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以 及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
*有机溶剂深沉法 如乙醇,丙酮等沉淀。
现在十三页，总共二十五页。
*重金属盐沉淀法析 金属离子 *生物碱试剂和某些酸类沉淀法析 生物碱 *加热变性沉淀法析 加热
现在十四页，总共二十五页。
四 蛋白质分离纯化的一般原则
前处理 组分级处理 细分级处理
现在十五页，总共二十五页。
五 蛋白质分离纯化的方法
根据分子大小不同 透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤 根据溶解度差别
等电点沉淀、PH控制、蛋白质盐溶和盐析、有机溶剂
、温度 根据电荷不同 电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦
(五) 凝胶过滤法测定相对分子质量
现在七页，总共二十五页。
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定
蛋白质分子质量
每两个氨基酸残基结合一SDS分子 后果：
1 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差 别。
2 改变了蛋白质单体分子的构象。 公式：
现在八页，总共二十五页。
形状
X射线晶体结构分析
现在九页，总共二十五页。
三 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一)胶体性质
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万 至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为 胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷
水化膜
现在十页，总共二十五页。
水化膜
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
第6章 蛋白质的分离、纯化和表征
蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两 方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相 对稳定的。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
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凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝 胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维 持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷， 这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的 质量和带电荷的多少有关，我们介绍其中常用的几种 主要的电泳技术。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 （sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），使蛋白 质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时破坏二硫键（使 二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连 接的，分离的状态。
第六章 蛋白质的分离纯化和表征
重点： 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、蛋白质的分离纯化方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 难点： 蛋白质分子量的测定
第一节：蛋白质的酸碱性质
1．两性解离
蛋白质分子中有很多酸性解离基 团和碱性解离基团，是具有两性解离性质 的化合物。
各种解离基团的解离度与溶液的 pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白 质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升 高，则解离情况相反。
蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率
这样造成两个后果： ① SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷
超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质 间原有的电荷差别。
因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样 的电荷/蛋白质比向正极移 动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均
二．凝胶过滤法
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的 技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足 够长的柱子中，作成一个凝胶柱。 原理：当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上 时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地 穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长， 而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小 的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间 越长。
3．等电沉淀和蛋白电泳
等电沉淀技术：在等电点pH条件下， 蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导 电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低 值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被 用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技 术。
电泳：带电颗粒在电场中泳动的现象 称为电泳。
蛋白电泳：溶液pH值不等于等电点； 直流电场。用于蛋白质的分离和纯化。
凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此， 大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱 下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取 决于要纯化的蛋白质分子量。
大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。在一 定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗 脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质 分 Nhomakorabea量的测定。
第二节：蛋白质相对分子质量的测定
一．化学测定法
首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一特殊 成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后， 假定蛋白质分子中该元素只有一个原子（或一分子 某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分 子质量：
最小相对分子质量=已知成分的相对分子质量（或 相对原子质量）/已知成分的百分含量×100。例如： 测得铁的百分含量为a,则该蛋白的最低相对分子质 量为：a/铁的相对原子质量
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用 来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE中，去 污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的 蛋白质样品的变性状态。
3.SDS-PAGE测未知蛋白质分子量
三．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS：烷基十二酯硫酸纳，变性剂。
1.定义：电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁 移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先 制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就 可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电 泳（gel electrophoresis）。
为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变 化。
电泳相对迁移率（μR）=蛋白质分子泳动的距离 /原点到前沿的距离
电泳相对迁移率（μR）与标准蛋白相对分子质 量的对数作图得标准曲线
根据未知相对分子质量的μR可从图上查得相对 分子质量。
由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS 通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大 约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋 白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物 的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质 分子量的大小成比例。
2．等电点
调节溶液的pH可以改变蛋白质分子的带电状 况。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负 电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质 的等电点（pI）。等电pH并不是一个恒定的值， 它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所 不同。
等离子点 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则 没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决 定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子 点是蛋白质的特征性常数。
双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是
分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后 的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出 蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量 上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点 不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质 分开。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 （sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），使蛋白 质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时破坏二硫键（使 二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连 接的，分离的状态。
第六章 蛋白质的分离纯化和表征
重点： 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、蛋白质的分离纯化方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 难点： 蛋白质分子量的测定
第一节：蛋白质的酸碱性质
1．两性解离
蛋白质分子中有很多酸性解离基 团和碱性解离基团，是具有两性解离性质 的化合物。
各种解离基团的解离度与溶液的 pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白 质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升 高，则解离情况相反。
蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率
这样造成两个后果： ① SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷
超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质 间原有的电荷差别。
因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样 的电荷/蛋白质比向正极移 动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均
二．凝胶过滤法
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的 技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足 够长的柱子中，作成一个凝胶柱。 原理：当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上 时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地 穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长， 而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小 的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间 越长。
3．等电沉淀和蛋白电泳
等电沉淀技术：在等电点pH条件下， 蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导 电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低 值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被 用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技 术。
电泳：带电颗粒在电场中泳动的现象 称为电泳。
蛋白电泳：溶液pH值不等于等电点； 直流电场。用于蛋白质的分离和纯化。
凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此， 大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱 下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取 决于要纯化的蛋白质分子量。
大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。在一 定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗 脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质 分 Nhomakorabea量的测定。
第二节：蛋白质相对分子质量的测定
一．化学测定法
首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一特殊 成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后， 假定蛋白质分子中该元素只有一个原子（或一分子 某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分 子质量：
最小相对分子质量=已知成分的相对分子质量（或 相对原子质量）/已知成分的百分含量×100。例如： 测得铁的百分含量为a,则该蛋白的最低相对分子质 量为：a/铁的相对原子质量
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用 来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE中，去 污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的 蛋白质样品的变性状态。
3.SDS-PAGE测未知蛋白质分子量
三．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS：烷基十二酯硫酸纳，变性剂。
1.定义：电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁 移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先 制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就 可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电 泳（gel electrophoresis）。
为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变 化。
电泳相对迁移率（μR）=蛋白质分子泳动的距离 /原点到前沿的距离
电泳相对迁移率（μR）与标准蛋白相对分子质 量的对数作图得标准曲线
根据未知相对分子质量的μR可从图上查得相对 分子质量。
由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS 通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大 约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋 白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物 的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质 分子量的大小成比例。
2．等电点
调节溶液的pH可以改变蛋白质分子的带电状 况。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负 电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质 的等电点（pI）。等电pH并不是一个恒定的值， 它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所 不同。
等离子点 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则 没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决 定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子 点是蛋白质的特征性常数。
双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是
分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后 的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出 蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量 上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点 不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质 分开。