第六章蛋白质的分离纯化和表征

二．凝胶过滤法
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的 技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足 够长的柱子中，作成一个凝胶柱。 原理：当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上 时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地 穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长， 而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小 的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间 越长。
2．等电点
调节溶液的pH可以改变蛋白质分子的带电状 况。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负 电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质 的等电点（pI）。等电pH并不是一个恒定的值， 它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所 不同。
等离子点 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则 没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决 定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子 点是蛋白质的特征性常数。
蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率
这样造成两个后果： ① SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷
超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质 间原有的电荷差别。
因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样 的电荷/蛋白质比向正极移 动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 （sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），使蛋白 质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时破坏二硫键（使 二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连 接的，分离的状态。
第六章 蛋白质的分离纯化和表征
重点： 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、蛋白质的分离纯化方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 难点： 蛋白质分子量的测定
第一节：蛋白质的酸碱性质
1．两性解离
蛋白质分子中有很多酸性解离基 团和碱性解离基团，是具有两性解离性质 的化合物。
各种解离基团的解离度与溶液的 pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白 质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升 高，则解离情况相反。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用 来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE中，去 污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的 蛋白质样品的变性状态。
3.SDS-PAGE测未知蛋白质分子量
凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此， 大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱 下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取 决于要纯化的蛋白质分子量。
大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。在一 定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗 脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质 分子量的测定。
双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是
分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后 的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出 蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量 上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点 不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质 分开。
凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝 胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维 持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷， 这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的 质量和带电荷的多少有关，我们介绍其中常用的几种 主要的电泳技术。
由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS 通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大 约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋 白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物 的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质 分子量的大小成比例。
第二节：蛋白质相对分子质量的测定
一．化学测定法
首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一特殊 成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后， ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定蛋白质分子中该元素只有一个原子（或一分子 某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分 子质量：
最小相对分子质量=已知成分的相对分子质量（或 相对原子质量）/已知成分的百分含量×100。例如： 测得铁的百分含量为a,则该蛋白的最低相对分子质 量为：a/铁的相对原子质量
三．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS：烷基十二酯硫酸纳，变性剂。
1.定义：电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁 移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先 制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就 可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电 泳（gel electrophoresis）。
为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变 化。
电泳相对迁移率（μR）=蛋白质分子泳动的距离 /原点到前沿的距离
电泳相对迁移率（μR）与标准蛋白相对分子质 量的对数作图得标准曲线
根据未知相对分子质量的μR可从图上查得相对 分子质量。
3．等电沉淀和蛋白电泳
等电沉淀技术：在等电点pH条件下， 蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导 电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低 值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被 用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技 术。
电泳：带电颗粒在电场中泳动的现象 称为电泳。
蛋白电泳：溶液pH值不等于等电点； 直流电场。用于蛋白质的分离和纯化。