SDSPE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制在生物化学和分子生物学的研究领域中，SDSPAGE 电泳是一种常用的技术手段，用于分离和分析蛋白质。
而要成功进行 SDSPAGE 电泳实验，准确配制各种试剂是至关重要的一步。
接下来，让我们详细了解一下 SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。
首先，我们来谈谈分离胶缓冲液的配制。
分离胶缓冲液通常使用TrisHCl 缓冲液，其 pH 值一般在 88 左右。
配制时，我们需要称取一定量的 Tris 碱，然后加入适量的浓盐酸进行调节 pH 值。
这个过程需要用到 pH 计来精确测量，以确保 pH 值的准确性。
一般来说，每升分离胶缓冲液中，Tris 的用量约为 1815g，而浓盐酸的用量则需要根据实际测量的 pH 值进行调整。
接下来是浓缩胶缓冲液的配制。
浓缩胶缓冲液的 pH 值通常为 68，同样使用 TrisHCl 缓冲液。
配制方法与分离胶缓冲液类似，但 Tris 的用量和浓盐酸的用量有所不同。
每升浓缩胶缓冲液中，Tris 的用量约为 606g，浓盐酸的用量也需要根据实际 pH 值测量结果进行微调。
然后是 30%丙烯酰胺溶液的配制。
这是 SDSPAGE 电泳中的关键试剂之一。
丙烯酰胺是一种有毒物质，在配制过程中需要特别小心。
我们将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照 29:1 的比例混合。
称取 29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺，加入适量的去离子水，搅拌溶解后，定容至 100ml。
需要注意的是，丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套在通风橱中进行。
SDS 溶液的配制也不能马虎。
SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂。
称取 10g SDS，加入适量的去离子水，加热搅拌溶解后，定容至 100ml。
10%过硫酸铵溶液是引发丙烯酰胺聚合的重要试剂。
称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。
因为过硫酸铵溶液不稳定，容易分解，所以不宜长时间保存。
电泳缓冲液也是必不可少的。
SDS-PAGE自制胶操作规程
SDS-PAGE自制胶操作规程一：试剂准备SDS-PAGE电泳所用溶液：30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
将商品用的40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为30 %，冰箱4℃保存。
分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：23.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至8.8，定容至150mL。
浓缩胶缓冲液0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8： 6.0gTirs碱，溶于60mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL。
10％SDS：2gSDS溶于去离子水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。
10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，溶于1mL去离子水中；现配现用或分装冷冻备用。
TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
1×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱 3.03甘氨酸(电泳级) 14.4gSDS 1g2×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5mL)0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 1 mLSDS 0.25g甘油0.189gβ-巯基乙醇 2.5ml(DTT（二硫苏糖醇）0.385g溴酚兰0.001g双蒸水定容到5ml考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1.0g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）450mL乙醇（甲醇）450mL冰醋酸100mLddH2O 450mLPH7.4PBS（0.01M）1LKH2PO4 1 mLNa2HPO40.25gNaCl 0.189gKCl 2.5ml二：凝胶配置1 2 3 41．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。
玻璃板应保持干燥洁净。
SDS-PAGE所有详细试剂配方
S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTris-HCL名称用量备注Tris 12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
【保存条件】室温保存。
【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。
1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5MTris-HCL名称用量备注Tris 18.17g去离子水80ml浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
SDS-PAGE配制方法
10%（W/V, g/ml）过硫酸铵（APs）的配制：（100 ml）1. 称取10g过硫酸铵；2. 加入100 ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；3. 贮存于4℃。
注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会失去催化效果。
5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：（1 L）1. 称取Tris粉末15.1 g、Glycine（甘氨酸）94 g、SDS 5.0 g；2. 加入约800 ml的去离子水，搅拌溶解；3. 加去离子水定容至1 L，室温保存。
注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制（方案一）：（5 ml）（本方案摘自Takara网站）组分：Tris-HCl pH6.8（250 mM）；SDS （10%）；溴酚兰（0.5%）；甘油（5 0%）；β-巯基乙醇（5%）配制过程：1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 1.25 ml；甘油2.5 ml；称取SDS固体粉末0.5 g；溴酚兰25 mg；2. 加入去离子水溶解后定容至5 ml；3. 小份（500 μl）分装后，于室温保存。
4. 使用前将25 μl的β-巯基乙醇加入到每小份中去。
5. 加入β-巯基乙醇的上样Buffer可以在室温下保存一个月左右。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制（方案二）：（10 ml）（本方案摘自《蛋白质技术手册》汪家政、范明）组分：Tris-HCl pH6.8（60 mM）；SDS （2%）；溴酚兰（0.1%）；甘油（25%）；β-巯基乙醇（14.4 mM）配制过程：1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 0.6 ml；50%的甘油5 ml；10%的SDS溶液2 m l；1%的溴酚兰1 ml；2. 加入去离子水定容至10 ml；3. 分装；4. 在4℃可保存数周，-20℃可保存数月之久。
SDS-PAGE试剂配方
SDS-PAGE试剂配方SDS-PAGE电泳所用溶液:30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)丙烯酰胺 (Arc) 29 gN,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4?存放丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH 值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4?贮存。
5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)Tris碱 15.1 g甘氨酸(电泳级) 94 g10 %SDS 50 mL使用时稀释5倍使用2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL10,(W/V)SDS 4 mL甘油 2 mLβ-巯基乙醇 1.0 mL(DTT(二硫苏糖醇) 0.31g)溴酚兰 0.02g双蒸水 0.5 mL室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 (G-250) 1.0 g甲醇 450 mL冰醋酸 100 mLddHO 450 mL 20.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95,乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液(甲醇脱色液效果好，但有毒性)甲醇 100 mL冰醋酸 100 mLddHO 800 mL 2医用酒精:冰醋酸:水=4.5:0.5:5(V:V:V)SDS-PAGE所需溶液:A液——30,丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4?贮存。
B液——1.5mol/L Tris?HCl，pH8.8:18.17g(9.09g)Tirs碱，溶于80mL(40mL)去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL(50mL)。
C液——1.5mol/L Tris?HCl，pH6.8:12.1g(6.05g)Tirs碱，溶于80mL(40mL)去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL(50mL)。
sdspage电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；4) 4⨯分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；5) 4⨯浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；6) 10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL；7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。
SDS-PAGE电泳相关溶液的配置
电泳相关溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。
2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g 加dH2O定容至1000ml。
3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl （pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。
4、染色液的配制（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。
加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。
充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。
当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。
5、脱色液（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。
收集液的SDS-PAGE分析：1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。
分离胶配方Resolving Gel (10ml)6%8%10%12%15%H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.430% acrylamide mix 2.0 2.7 3.3454x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.520% SDS0.050.050.050.050.0520% APS0.050.050.050.050.05TEMED0.0080.0060.0040.0040.004浓缩胶配方（10ml）H2O 6.9 ml30% acrylamide mix 1.7 ml8x stacking-gel buffer1.25 ml20% SDS0.05 ml20% APS0.05 mlTEMED0.01 ml2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
SDS电泳溶液的配置
1、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
试剂
浓度
称重
备注
Tris
0.125 M
15.1g
加入800 ml的双蒸水溶解，
定容至1 L，室温保存
甘氨酸（Glycine）
1.25 M
94g
SDS
0.5%（W/V）
5g
2、染色液
试剂
浓度
称重
备注
乙醇
25%（V/V）
250 mL
双蒸水溶解，定容至1 L，滤纸过滤后，室温保存
9、浓缩胶缓冲液（pH6.8）－0.5mol/L Tris－HCl
试剂
浓度
称重
备注
Tris
0.5mol/L
6.06g
调pH6.8，定容至100ml，
滤纸过滤，室温保存
1mol/L HCl
48%V/V）
48 ml
注：或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml.
10、5×上样缓1%（W/V）
1g
5、10%过硫酸铵（APS）
试剂
浓度
称重
备注
过硫酸铵
10%（W/V）
1g
溶解10 ml双蒸水，4℃避光保存
6、10%SDS（十二烷基硫酸钠）
试剂
浓度
称重
备注
SDS
10%（W/V）
10 g
定容100ml双蒸水，滤纸过滤，室温保存
7、1mol/L HCl
试剂
浓度
称重
备注
HCl
1mol/L
15ml
加水稀释至180ml
8、分离胶缓冲液（pH8.9）－1.5mol/L Tris－HCl
sds-page 试剂配制
SDS-PAGE 试剂配制
凝胶脱色染色方法：
溶液1：无水乙醇250mL，冰醋酸50mL，水200mL；
溶液2：无水乙醇50mL，冰醋酸37.5mL，水437.5mL；
溶液3：0.25g考马斯亮蓝R-250 溶于100mL 95%乙醇中，滤纸过滤，待用。
电泳结束，取出胶放在胶盒中，加约50mL溶液1，微波炉加热1min，摇床摇10-20nin；倒掉溶液1，加入溶液2，再加1mL溶液3，混匀，微波炉加热1min，摇床摇，直至条带染色清晰为止。
上样缓冲液（5×）：（5×loading buffer）有
10%（W/V,g/ml）过硫酸铵（APs）的配制：（1ml）
1.称取0.1g过硫酸铵；
2.加入1ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；
3.贮存于4℃。
注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会失去催化效果。
5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：（1L）
1.称取Tris粉末15.1g、Glycine（甘氨酸）94g、SDS5.0g；
2.加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；
3.加去离子水定容至1L，室温保存。
注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
sds-page配方
SDS-PAGE 电泳8%分离胶5ml 7.5ml 10mlH2O 2300（微升，下面都一样）3450 460030%Acrylamide 1300 2025 27001.5M Tris-HCl (Ph8.8) 1300 1875 250010%SDS 50 75 10010%过硫酸铵50 75 100TEMED 3 4.5 612%分离胶5ml 7.5ml 10mlH2O 1600 2475 330030%Acrylamide 2000 3000 40001.5M Tris-HCl (Ph8.8) 1300 1875 250010%SDS 50 75 10010%过硫酸铵50 75 100TEMED 2 3 4浓缩胶5ml 7.5mlH2O 1700 340030%Acrylamide 415 8301.5M Tris-HCl (Ph8.8) 315 63010%SDS 25 5010%过硫酸铵25 50TEMED 2.5 51.将以上溶液混合均匀，用1ml枪吹打几下2.现配分离胶，将配制好的胶慢慢打入，胶里不能有气泡。
3.分离胶加入到2/3处，再加入去离子水，压胶，保持分离胶水平4.待分离胶凝固后，将水倒出来，用滤纸吸干，差不多就可以~5.配制浓缩胶，插梳子（用蒸馏水洗干净）6加入电泳缓冲液，倒个一半左右？7点样的时候慢慢点，因为点样速度快了，容易冒出来8跑胶的时候，先用80V跑，等样品跑完浓缩胶，就换电压，换到120V得跑个2h左右吧~ （不用那么仔细，你配的胶你估摸着差不多就行）,跑完浓缩胶，蛋白和marker都是呈一条细线这时候你就可以换电压了~9跑完的胶，拿出来用蒸馏水冲几次，放入平皿，加染色液，能覆盖胶就行，摇7,8h，摇完了把染色液倒出来（可以回收，但是效果不怎么好），用蒸馏水冲几次，加入脱色液，再摇摇到你能看见条带，目的蛋白就可以~要是你闲时间太长，加染色液放微波炉，打个两三分钟，脱色的时候加脱色液放微波炉，打2,3分钟，据说这个方法也可以，但是效果不好，而且我没有试过，要不你试试？建议你买个SDS-PAGE的试剂盒吧，要不然配试剂得配个一天。
实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳准备实验
9、脱色液（第四组） 甲醇 冰醋酸 水
500 ml 228.00 ml 36.00 ml 236.00 ml
表3 分离胶的配制 Table 3 The confect of separating gel
实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 准备实验
----------溶液的配置
实验内容
一、变性蛋白质电泳系列溶液
1、单体母液 （第一小组） 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 25 ml 7.50 g 0.20 g
去离子水定容至25 ml ,定性中速滤纸过 滤，棕色试剂 瓶4℃存放。 2、 10％ (w/v) SDS （第一小组） 10ml SDS g 去离子水 10 ml
3、分离胶缓冲液（4×，pH=8.80，25 ml）（第二小组） Tris-Base(1.5 mol/L) 4.54 g 10％(w/v)SDS 1 ml 用20ml去离子水溶解，再用浓HCl调节pH到8.8，过 滤，定容到25ml,4℃存放。
4、浓缩胶缓冲液（4× ，pH=6.80，50 ml ）（第二小组） Tris-Base(0.50 mol/L) 3.03 g 10％(w/v)SDS 2ml 加去离子水40 ml溶解，用浓HCl调pH到6.80，定 容到50ml，4℃存放。
5、10％的过硫酸铵（1ml） （现配现用） （第三小组） 过硫酸铵 0.10 g 去离子水1.00 ml,4℃密闭存放。 6、电极缓冲液(pH=8.30) 500 ml(1×) ）（第三小组） Tris-Base 1.5g 甘氨酸 6.25 g SDS (10%) 2.5ml 去离子水溶解。
7、样品缓冲液储液（2× ）（第四小组） 2.5 ml 浓缩胶缓冲液（4×） 1.25 ml SDS（固体干粉） 0.1 g 甘油 0. 5 ml 溴酚兰 1 mg 加去离子水0.75ml 溶解，加50ul巯基乙醇，室温保存。
SDSPAGE所有详细试剂配方
SDSPAGE所有详细试剂配方SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用于蛋白质分析的实验技术。
该技术通常涉及到几种试剂，如胶溶液、缓冲液、电泳缓冲液、染色溶液等。
下面是SDS-常见的试剂配方及其详细说明。
一、胶溶液配方：1. 30%（w/v）丙烯酰胺（acrylamide）溶液- 在称量瓶中称取30g丙烯酰胺，并用蒸馏水调至100ml。
搅拌溶解直至均匀。
-这是制备聚丙烯酰胺凝胶的基础溶液。
2. 响应稀释液（Response diluent）-用于稀释聚丙烯酰胺溶液以获得不同浓度的凝胶。
-可通过将聚丙烯酰胺溶液与水按1:3体积比混合来制备响应稀释液。
二、缓冲液配方：1. 离子化追踪剂（Tris-Glycine running buffer）-用于凝胶电泳盒中电解质的运行。
-配方为：3g Tris base （pH 8.8）14.4g glycine将固体溶解于1L蒸馏水中，并调整pH至8.8三、电泳缓冲液配方：1. 离子化追踪剂（Tris-Glycine SDS running buffer）-用于在电泳过程中提供离子追踪剂。
-配方为：30g Tris base144g glycine10gSDS将固体溶解于1L蒸馏水中。
2. 加速剂（stacking gel buffer）- 用于形成凝胶中的聚集堆积层（stacking layer）。
-配方为：30g Tris base （pH 6.8）144g glycine1gSDS将固体溶解于1L蒸馏水中，并调整pH至6.8四、样品处理缓冲液配方：1. 样品加载缓冲液（sample loading buffer）-用于处理蛋白样品，以便在凝胶上获得良好的分离效果。
-配方为：0.5M Tris-HCl（pH 6.8）20%（v/v）甘油10%（w/v）SDS0.05%（w/v）溴酚蓝（bromophenol blue）旋转混合并加入蛋白样品。
五、凝胶染色溶液配方：1. 吸附性染色剂（Coomassie blue staining solution）-用于染色聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制SDSPAGE 电泳（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
在进行 SDSPAGE 电泳实验时，准确配制各种试剂是获得可靠实验结果的关键。
下面，让我们详细了解一下SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。
首先，我们来看看分离胶缓冲液的配制。
分离胶缓冲液一般是 15M TrisHCl（pH 88）。
要配制 100ml 的这种缓冲液，我们需要称取 1817g Tris 碱，加入约 80ml 去离子水，用浓盐酸调节 pH 值至 88。
这一步需要耐心和细心，因为 pH 值的准确性对电泳结果影响很大。
调节好 pH 后，将溶液定容至 100ml。
接下来是浓缩胶缓冲液，通常是 10M TrisHCl（pH 68）。
同样配制100ml，称取 1211g Tris 碱，加入约 80ml 去离子水，用浓盐酸调 pH 至68，最后定容至 100ml。
然后是 30%丙烯酰胺溶液。
这是 SDSPAGE 电泳中非常重要的试剂。
配制 100ml 该溶液，需要称取 29g 丙烯酰胺和1g N,N’亚甲双丙烯酰胺，用去离子水溶解后定容至 100ml。
丙烯酰胺是有毒物质，在配制和使用过程中要特别小心，避免接触皮肤和吸入粉末。
SDS 溶液的配制也不容忽视。
一般是 10%（w/v）的 SDS 溶液。
称取 10g SDS，加入适量去离子水搅拌溶解，然后定容至 100ml。
还有 10%过硫酸铵溶液。
称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。
过硫酸铵溶液容易失效，所以每次使用前都要新鲜配制。
TEMED（四甲基乙二胺）在凝胶聚合过程中起到催化作用。
由于它挥发性强，使用时要注意迅速加入。
电泳缓冲液也是必不可少的。
一般使用的是 Tris甘氨酸缓冲液。
配制 1L 缓冲液，需要称取 303g Tris 碱、1877g 甘氨酸和 1g SDS，用去离子水溶解后定容至 1L。
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，可以将蛋白质按照其分子量大小分离出来。
在这个过程中，需要使用一系列试剂来形成凝胶、还原并变性蛋白质样品、以及进行电泳。
下面我们将介绍SDS-PAGE电泳试剂的配制方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳胶液配制1. 蒸馏水将蒸馏水取2L，通过0.22μm的滤膜过滤3遍来除杂质，备用。
2. 均聚化溶液将40%（w/v）丙烯酰胺10mL，在干燥器中烘干2小时，然后加入蒸馏水固定容积至50mL。
将10%（w/v）N, N’-二甲基亚硫脲5mL加入均聚化溶液中，搅拌30分钟至完全溶解。
3. 凝胶制备将均聚化溶液加入10%（w/v）的三甲基丙烯酰氨基甲基纤维素，搅拌5分钟后加入0.1%TEMED等待至少1小时凝胶化。
4. 等电聚焦凝胶制备将均聚化溶液加入3.33%（w/v）等电聚焦剂，根据需要调节pH值，搅拌5分钟后加入氨基甲酸1mL，搅拌2分钟至完全溶解。
加入TEMED及APS，混合倒入制好的除尘洞中，并插入梳子。
至少1小时后移除梳子，使凝胶完全凝固。
蛋白样品处理试剂配制1. SDS缓冲液将10%SDS 1.25mL加入pH6.8的磷酸盐缓冲液（1M），加入蒸馏水固定容积至100mL，搅拌10分钟至SDS完全溶解，备用。
2. β-巯基乙醇将β-巯基乙醇400μL加入1mL磷酸盐缓冲液（1M），备用。
3. 样品缓冲液将10%SDS 100μL，β-巯基乙醇50μL加入磷酸盐缓冲液1mL中，加入蒸馏水固定容积至10mL，轻轻搅拌即可。
4. 热变性载入缓冲液将4倍浓度的样品缓冲液加入β-巯基乙醇，于100℃水浴中加热5分钟。
冷却至室温，即可使用。
电泳相关试剂配制1. 电泳缓冲液将磷酸盐缓冲液1L加入SDS 10g进行混合后，加入蒸馏水将其固定至2L，备用。
2. Anode buffer将磷酸盐缓冲液1L加入SDS 5g进行混合后，加入蒸馏水将其固定至2L，备用。
SDS-PAGE、Native及2D电泳试剂配方
第一章 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 储存液① 2 M Tris-HCl(pH 8.8), 100ml 24.2g Tris + 50ml 蒸馏水+浓盐酸至 pH 8.8 (4ml)，待室温+蒸馏水至100ml 。
② 1 M Tris-HCl(pH 6.8), 100ml 12.1g Tris + 50ml 蒸馏水+浓盐酸至 pH 6.8 (8ml)，待室温+蒸馏水至100ml 。
③ 10% (w/v)SDS, 100ml, 室温保存 10g SDS+蒸馏水至100ml 。
④ 50% (v/v) 甘油，100ml 50ml 100%甘油+50ml 蒸馏水⑤ 1% (v/v) 溴酚蓝，10ml 100mg 溴酚蓝+蒸馏水至10ml ，搅拌至完全溶解，过滤除去聚合的染料。
2. 工作液① A 液：丙烯酰胺储存液，100ml 30% (w/v)丙烯酰胺（Acrylamide ）,0.8% (w/v)双丙烯酰胺(Bisacrylamide)30g 丙烯酰胺+0.8g 双丙烯酰胺+蒸馏水至100ml 。
有毒，戴手套和口罩在通风橱中操作，石蜡封口，避光4℃保存。
② B 液：4×分离胶缓冲液，100ml 75ml 2M Tris-HCl(pH 8.8)(1.5M)+4ml 10% SDS(0.4%)+21ml 蒸馏水 4℃保存数月。
③ C 液：4×堆积胶缓冲液，100ml 50ml 1M Tris-HCl(pH 8.8)(0.5M)+4ml 10% SDS(0.4%)+46ml 蒸馏水 4℃保存数月。
④ 10% AP(过硫酸铵)， 5ml 0.5g 过硫酸铵+5ml 蒸馏水 密封的管内，4℃保存数月。
⑤ 5×样品工作液，10ml 0.6ml 1M Tris-HCl (pH 6.8)(60mM)+5ml 50% 甘油(25%)+2ml 10% SDS (2%)+0.5ml α-巯基乙醇（14.4mM ）+1ml 1%溴酚蓝(0.1%)+0.9ml 蒸馏水 4℃保存数周，-20℃保存数月。
SDSPE电泳试剂配制
S D S P E电泳试剂配制Work hard in everything, everything follows fate!SDS-PAGE电泳试剂1 30%储备胶溶液：丙烯酰胺Acr29.0g;亚甲基双丙烯酰Bis1.0g;混匀后加ddH2O;37O C溶解;定容至100 mL;棕色瓶存于4O C；2 1.5M Tris-HClpH ：Tris 18.17g加ddH2O溶解;浓盐酸调pH至;定容至100mL；3 1M Tris-HClpH ：Tris 12.11g加ddH2O溶解;浓盐酸调pH至;定容至100 mL；4 4分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HClpH ;定容至100mL；5 4浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HClpH ;定容至100mL；6 10电泳缓冲液pH ： Tris 3.029g;甘氨酸14.415g;SDS 1g加ddH2O溶解;定容至100mL；7 10%过硫酸铵Aps;现配：1g AP加ddH2O至10mL；8 2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HClpH ;-巯基乙醇;SDS 0.6g;甘油 mL;%溴酚兰 mL;ddH2O ；9 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g;甲醇225 mL;冰醋酸50 mL;ddH2O225mL；10 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11 分离胶%: ddH2O 4mL;30%储备胶5 mL; 4分离胶缓冲液3mL; 10% Aps 现配;TEMEDN;N;N’;N’-四甲基乙二胺10μL；12 浓缩胶5％：ddH2O ;30%储备胶;4浓缩胶缓冲液; 10%Aps 50μL;TEMED 5μL..Tricine三羟甲基氨基甘氨酸- SDS - PAGE蛋白质电泳1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备1 正极缓冲液10 ×：14g Tris 溶于400mL 重蒸水;用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ;定容至500mL..2 负极缓冲液10 ×：将60. 55g Tris ;89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中;加水至终体积为500mL..3 凝胶缓冲液3 ×：将181. 5g Tris ;1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中;用1M HCl 滴定至pH8. 45 ;再加水稀释至500mL..2 丙烯酰胺储存液配制1 3C-丙烯酰胺储存液3C-stock将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液..2 5C-丙烯酰胺储存液5C-stock用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液..3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作1 小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液3x、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL ; 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED..2 夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液3x、0. 61 mL“3C凝胶储存液”; 用去离子水稀释至3 mL ; 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED..3 浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液3x、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”; 用去离子水稀释至2 mL ; 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED..用垂直小电泳槽制胶电泳..先铺小孔胶; 接着均匀注入夹层胶; 凝胶聚合后再铺浓缩胶..变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－PAGE分析1准备：电泳玻璃板用双蒸水洗净;戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干;按说明安装好电泳装置..2%分离胶灌制取一洁净的20mL烧杯;分别加入：ddH2O 4mL30%储备胶 5mL4分离胶缓冲液 3mL10% Aps现配100%TEMED轻轻旋转混匀溶液;用5mL移液器灌入玻璃板间;以水封顶;使液面平整..35％浓缩胶灌制取一洁净的20mL烧杯;分别加入：ddH2O30%储备胶4浓缩胶缓冲液10% Aps 50 μL100%TEMED 5 μL待分离胶凝聚后;再配制5%的积层胶;将分离胶上的水倒去;灌入积层胶;立即将梳子插入玻璃板间;待积层胶聚合后;拔出梳子;用蒸馏水洗尽凝胶顶部..4上样与电泳将凝胶玻板置于电泳槽中;加入事先准备好的电泳缓冲液;加样完毕后;使样品端与阴极连通;另一端与阳极相连;根据本试验蛋白质大小等各项特性;分离胶选用120V 固定直流电压;积层胶选用60V固定直流电压;当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳;约3小时..5染色及脱色电泳结束后;用考马斯亮蓝染液浸泡;放摇床上室温缓慢旋转2小时;回收染液;用脱色液浸泡凝胶;放摇床上室温缓慢摇动脱色;每两小时换一次脱色液;直至脱色完全后用数码像机拍照保存..。
SDS-PAGE相关试剂配制
1.30％（W/V）丙烯酰胺溶液配制名称用量备注Acrylamide 29gBIS 1g 充分搅拌溶解去离子水80ml 定容至100ml，0.45μm滤膜过滤除杂置于棕色瓶中4℃保存，（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，可通过皮肤吸收并具有累积性。
配制时应戴手套操作）2.10％（W/V）过硫酸铵名称用量备注过硫酸铵0.1g去离子水1ml 现配现用（注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）3.5X Tris－Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）名称用量备注Tris15.1gGlycine94.0gSDS 5.0g去离子水800ml 加入去离子水定容至1L后，室温保存4.1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸)名称用量备注Tris 12.1去离子水80ml浓盐酸9ml 预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存5. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸)名称用量备注Tris 18.17去离子水80ml浓盐酸3ml 预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存6.10%SDS名称用量备注SDS 10g去离子水80g 加入去离子水定容至100ml后，室温保存7.考马斯亮蓝R-250染色液名称用量备注考马斯亮蓝R-250 0.1g异丙醇25ml 搅拌溶解冰醋酸10ml 搅拌均匀去离子水65ml 搅拌均匀，滤纸除去颗粒物，室温保存8.考马斯亮蓝染色脱色液名称用量备注冰醋酸100ml乙醇50ml去离子水850ml 充分混匀后使用9.5×SDS-PAGE Loading Buffer：量取下列试剂，置于10ml塑料离心管中名称用量备注1MTris-HCL, pH=6.8 1.25mlSDS 0.5gBPB（溴酚蓝）25mg甘油 2.5ml去离子水至5ml 分装200ul/管2ME 10ul/100ul 使用前添加，添加后可室温保存一个月。
SDS-PAGE的制备
科欣雨飘SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、 材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS 、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。
30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。
过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
1. 10%十二烷基硫酸钠（SDS ）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS 带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
配制方法：10g SDS ，用双蒸水溶解并定容至100ml ，室温保存。
2. 10%过硫酸铵（Ap ）：引发剂。
能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
配制方法：0.1 g 过硫酸铵溶解于 1ml 双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。
同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
3. N 、N 、N ’、N ’－四甲基乙二胺（TEMED ）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP 产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
TEMED 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED 的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED 。
4. 30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis 贮液） : 含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。
丙烯酰胺单体（Arc ）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。
N ，N ’-甲叉双丙烯酰胺（Bis ），交联剂。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
SDS-PAGE配制方法
SDS-PAGE配制方法10%（W/V, g/ml）过硫酸铵（APs）的配制：（100 ml）1. 称取10g过硫酸铵；2. 加入100 ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；3. 贮存于4℃。
注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会失去催化效果。
5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：（1 L）1. 称取Tris粉末15.1 g、Glycine（甘氨酸）94 g、SDS 5.0 g；2. 加入约800 ml的去离子水，搅拌溶解；3. 加去离子水定容至1 L，室温保存。
注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制（方案一）：（5 ml）（本方案摘自Takara网站）组分：Tris-HCl pH6.8（250 mM）；SDS （10%）；溴酚兰（0.5%）；甘油（5 0%）；β-巯基乙醇（5%）配制过程：1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 1.25 ml；甘油2.5 ml；称取SDS固体粉末0.5 g；溴酚兰25 mg；2. 加入去离子水溶解后定容至5 ml；3. 小份（500 μl）分装后，于室温保存。
4. 使用前将25 μl的β-巯基乙醇加入到每小份中去。
5. 加入β-巯基乙醇的上样Buffer可以在室温下保存一个月左右。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制（方案二）：（10 ml）（本方案摘自《蛋白质技术手册》汪家政、范明）组分：Tris-HCl pH6.8（60 mM）；SDS （2%）；溴酚兰（0.1%）；甘油（25%）；β-巯基乙醇（14.4 mM）配制过程：1. 量取1M Tris-HCl （pH6.8） 0.6 ml；50%的甘油5 ml；10%的SDS溶液2 m l；1%的溴酚兰1 ml；2. 加入去离子水定容至10 ml；3. 分装；4. 在4℃可保存数周，-20℃可保存数月之久。
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S D S P E电泳试剂配制集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
SDS-PAGE电泳试剂
1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀
O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；
后加ddH
2
O溶解,浓盐酸调pH至,定容至
2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH
2
100mL；
O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH
2
mL；
4) 4分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；
5) 4浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；
O溶解, 6) 10电泳缓冲液(pH ： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH
2
定容至100mL；
O至10mL；
7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH
2
8) 2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油mL，%溴酚兰 mL，ddH
O ；
2
1.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R
250
ddH
O 225mL；
2
O以2∶1∶7配制而成；
10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH
2
11) 分离胶%): ddH
O 4mL，30%储备胶5 mL， 4分离胶缓冲液3mL, 10% Aps
2
(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；
O ，30%储备胶，4浓缩胶缓冲液， 10%Aps 50μL，12) 浓缩胶（5％）：ddH
2
TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳
1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。
2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于
400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。
3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M HCl
滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。
2 丙烯酰胺储存液配制
1） 3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)
将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。
2） 5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)
用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。
3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作
1）小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
2）夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
3）浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至2 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
用垂直小电泳槽制胶电泳。
先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析
1）准备：
电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。
2）%分离胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 4mL
30%储备胶 5mL
4分离胶缓冲液 3mL
10% Aps(现配)
100%TEMED
轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。
3）5％浓缩胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O
30%储备胶
4浓缩胶缓冲液
10% Aps 50 μL
100%TEMED 5 μL
待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。
4）上样与电泳
将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约3小时。
5）染色及脱色
电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后用数码像机拍照保存。