生物膜耐药机制

细菌生物膜的耐药性机制的研究近况

随着抗生素的广泛应用,细菌对抗生素产生的耐药现象日益加重, 给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。近年来细菌对抗生素的耐药现象日益严重, 随着对生物膜研究的深入,发现细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关,亦与致病菌在体内形成生物膜有关。近些年来,对细菌生物膜的基础研究和临床研究成为国内外细菌耐药研究热点,本文在前人的研究基础上,对生物膜的耐药机制作综述,为了更好指导临床治疗方案。

细菌生物膜(Bacterial Biofilm ,BF) 是细菌在生长过程中为适应生存环境而不可逆的粘附于非生物或生物表面形成的一种与浮游细胞(plank tonic cell)相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的胞外基质组成。BF的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭。当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强(10一1000 倍),抗生素应用不能有效清除BF,还可诱导耐药性产生。BF通过多种机制参与耐药形成, 不同机制间还存在协同作用[1]。

1 抗菌药物渗透障碍 BF中的细菌合成的胞外基质及水不溶性胞外多糖等物质构成的细菌生物膜独特三维结构,是BF 细菌的保护装置,成为抗菌药物向BF 和BF 细菌菌体内渗透的天然屏障。BF的物理性阻碍作用,降低了菌体内抗菌药物的浓度,从而表现出耐药性。改变金黄色葡萄球菌胞外多糖中特定季铵盐疏水键长度,增加其疏水,该菌株的耐药性亦增高;若去除疏水基质,则对多数抗菌药物敏感。此外,胞外多糖所带的负电荷,可与带正电荷的抗菌药物结合,而阻止药物的进一步渗透。氟化喹啉虽易穿透生物膜,但也不能完全清除细菌生物膜内的细菌。这一现象表明,BF 阻止抗菌药物渗透,只是其耐药机制的一个方面[2]。

2 特殊的微环境药物活性调节与生物膜中细胞的生长速度密切相关，抗生素对快速生长细胞更有杀伤力。生物膜中的营养成分、代谢产物浓度、渗透压和氧浓度等，自外向内呈梯度下降。这种特殊微环境和营养条件，使其中的细菌生长速度较游离菌和浮游菌明显缓慢。深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢产物难以排出而堆积，因此，这些生物膜菌代谢活性很低，甚至处于休眠状态，菌体较小，不进行频繁的细胞分裂，对各种理化刺激、应激反应及药物均不敏感。Schauder等[3]发现当使用抗生素治疗时，生长快速的外层或表层细菌最敏感，首先被杀死；生长缓慢者敏感性下降，大部分被杀死；而生长停滞者则不敏感，待抗生素治疗停止后，残存细菌利用死亡细菌作为营养源迅速繁殖形成新的生物膜，这使感染反复发作，难以控制。

3 BF特殊的生物膜表型生物膜细菌与浮游菌相比,出现了生物膜环境所特有的基因表达模式,即对生长表面的粘附触发了部分细菌亚群基因表达的变化, 使其生物学行为也随之改变, 这称为生物膜表型。生物膜特有的表型能够激活其耐药机制。目前从mRNA 水平和蛋白水平寻找生物膜状态和浮游状态下基因表达的差别,是生物膜研究的一个热点。白色念珠菌拥有的编码外排泵的MDR 基因和耐药性相关基因——CDR 基因家族, 在生物膜中表达均有增强, 可能引起细胞膜上外排泵数目增多或活性增强, 导致生物膜中的菌株出现耐药性。而人工敲除细菌中的这些耐药性基因, 所培养的浮游菌株耐药性下降, 生物膜菌株耐药性却没有明显下降,表明耐药性并不是单一的耐药性基因所控制的

[4]。另有研究表明, 生物膜中有部分表型变异株在高抗生素浓度下能照常生长。Drenkard 等发现,铜绿假单胞菌中存在一种调节蛋白(PvrR),该蛋白控制铜绿假单胞菌对抗生素敏感和耐药的转化。这种表型变化通常是可逆的,并且高频率地随机发生,使生物膜具有较高的异质性, 有利于其应对突发的环境变化[5]。Deziel 等提出表型变化调控着细菌在生物膜和浮游状态之间的转化,它能保证当条件适宜时, 细菌能重新启动生物膜的形成[6]。

4 顽固耐药菌顽固耐药菌(persister)也被认为与生物膜的高耐药性有关。Brooun 等研究证明一定浓度抗生素能杀死生物膜内大多数细菌,但即使增加药物浓度,仍有少部分细菌存活[6]。Spoering 和Lewis 实7验证明处于静止阶段的浮游菌和生物膜内大部分细菌的耐药性相似,而一小部分顽固耐药菌是生物膜难以清除的主要原因[8]。Harrison 等也有类似的发现,生物膜在暴露于阳离子杀菌剂的前2 h~4 h 表现出两倍于浮游菌的耐药性,但两种状态的细菌27 h 后在同一浓度下被杀灭,他们认为是由于少数顽固耐药菌的存在导致出现该现象[9]。但目前对其确切的耐药机制仍不清楚, Keren 等得出它们并没有可遗传的耐药性传给子代,生物膜破坏后即恢复对抗生素的敏感性[10]。Lewis 等提出程序化细胞死亡(Programmed CellDeath,PCD)假说, 认为顽固耐药菌可能正是因为存在PCD 程序缺陷, 所以在抗生素引起细胞损伤而触发PCD造成大部分细菌死亡时, 顽固菌仍能存活,从而增加了生物膜的耐药性[11]。

5 细菌感应系统(quorom sensing,QS) 被认为在生物膜耐药性上起着作用。同种或不同种细菌通过各种信号传导系统对它们当前所处环境、群体密度的感知、交流,使菌体间相互协调生理活动以趋利避害。细菌通过互相传递一种胞外低相对分子质量的自诱导素(也称信息素),调节自身的基因表达，促使其黏附，聚集，进而形成完整的生物膜；当生物膜内的细菌数量过多时，QS会使一部分细菌从生物膜表面脱离，导致感染扩散或复发，引起临床症状。Gustafsson 等[12]发现葡萄球菌是引起骨科内植物感染的主要细菌，葡萄球菌的群体效应调控系统称为Agr系统(辅助基因调节系统),由一个专一的自诱导转运系统和一个调节信号转导系统构成。

6 激活应激反应也有人提出生物膜内细菌的耐药性与由生长速度启动的普遍应激反应(General stressresponse)有关，应激反应导致细菌的生理学改变，使其在各种环境下得到保护。σ因子rpoS是一种普遍应激反应的调控因子，能激活一系列基因的转录，使细菌在营养匮乏条件下维持生活力。Xu等[13]报道铜绿假单胞菌生物膜内细菌的σ因子rpoS相对于静止阶段的浮游菌表达水平高，提示生物膜内的环境如营养缺乏或有毒代谢产物的堆积，激活了σ因子rpoS的表达，使细菌发生生理变化以抵抗环境压力和抗生素作用。然而Whiteley等[14]用rpoS突变株形成的生物膜对妥布霉素的耐药性却比野生株生物膜更强，故rpoS在生物膜的耐药性中所起的作用还需进一步研究。

7 对抗机体免疫防御体制 BF细菌可利用多种方式对抗机体免疫防御机制：

①细菌生物膜的屏蔽作用：Feng等[15]发现在细菌生物膜中，大量的黏性基质包裹着细菌，形成了一个物理屏障，可以将细菌和机体免疫系统隔开，使机体的吞噬细胞和杀伤细胞及其所分泌的酶不能对细菌产生有效的攻击。②减少细胞因子的产生或酶解细胞因子。Leid等[16]发现铜绿假单胞细菌通过增加γ干扰素来抑制白细胞吞噬作用。③阻碍免疫细胞的吞噬调理作用，是ESS致病作用的另一重要方面,包括多形核白细胞对细菌的吞噬以及细胞内的分解作用。Leid