水产动物常见病原菌的耐药性分析及中草药体外抑菌活性的检测_张传亮

近年来, 随着水产养殖品种的增多、集约化程度 的提高和养殖环境的恶化, 各类病害亦频繁发生, 严 重制约了水产养殖业的持续发展。通过病原学研究 发现弧菌 ( V ibrio ) 、气单胞菌 ( A erom onas ) 、类志 贺邻 单胞菌 ( P lesiom onas shigelloides) 和假单胞菌 ( P seudom onas)是引起安徽省水产动物细菌性疾病常见的 4 种病原菌 [ 1] 。目前抗生素仍是防治这些细菌性疾病 的主要手段, 但是抗生素长期使用所致的细菌耐药性 问题和药 物残留 所致 的水产 品安全 问题愈 来愈 突 出 [ 2] 。因此, 加强某地区水产动 物常见病原菌的 耐
药性监测, 了解其耐药现状和耐药机制, 减缓耐药菌 株的产生, 同时研究开发既能有效防治细菌性疾病, 又能解决药物残留和细菌耐药性问题的渔用中草药
具有重要意义。本研究对安徽省水产动物常见病原 菌的耐药性进行了系统测定, 分析了其耐药现状和耐 药机制, 在此基础上选取 27种单味中草药和 5 个中 草药复方配伍测定其对常见病原菌耐药菌株的体外
aerug inosa stra ins in a ll de tected pa thogens m ight produce ESBLs and the rate of ESBL s was 8. 69% . Rh izoma cop tid is,
Rheum officinale, F los lonicerae, Sp ica p runellae, Euphorbia hum ifusa, Cortex M outan, Por tu laca oleracea L. and Fructus for-
耐药率均为 100% 。供试菌中仅检出 2株铜绿假单胞菌为 产 ESBL s株, 检出率为 8. 69% 。黄连、大黄、金银花、夏枯
草、地锦草、丹皮、马齿苋和连翘 8种中草药对供试耐药株均有较强的抑制活 性, 其 中黄连、大黄和金 银花的抑菌 活 性尤为明显, 其 M IC值分别介于 1. 96~ 125 g /L、7. 84~ 125 g /L 和 15. 68~ 250 g /L。 5个复方配伍中以复方 5的配
of common pa thogens had resistance to common antib io tics at different ex tent. 2 P seudom onas aerugino sa stra ins had the
broadest spectrum of drug res istance and the ir resistant rate to 14 kinds of antib iotics we re 100% . O nly 2 P seudomonas
used to detect the drug resistance and ESBL s o f comm on pathogens respective ly, bacte rio stas is activ ity of Ch inese herb
m edicine w ere assay ed by P lat stile tto m ethod and improved m icrodilution m ethod in vitro. R esults 23 strains o f four k inds
药株具有良好的抑菌活性。
【关键词】 水产动物; 病原菌; 耐药性; 中草药; 抑 菌活性
【中图分类号】R 378
【文献标识码】A
D rug resistance analysis of comm on pathogens of aquatic an im als and bacteriostasis
the best com pa tible effect and itsM IC w as 1. 96~ 15. 68 g /L and its bacter iostasis activ ity w as sign ificantly higher than s in-
g le- flavo r Chinese herb; fo llow ed by the com pounded ex tract 1 and 3, the ir M IC we re from 1. 96 to 62. 72 g /L; compoun-
sy thiae had strong inhibition activ ity to detected pathogens, espec ia lly Rhizom a cop tidis, Rheum officinale, F los lonicerae, and
their M IC w ere among 1. 96~ 125 g /L, 7. 84~ 125 g /L, 15. 68~ 250 g /L respective ly. T he fifth com pounded extract had
【摘要】 目的 了解安徽省水 产动物常见病原菌的耐药现 状和耐药 机制, 探讨 27 种单味 中草药 和 5个中 草
药复方配伍对耐药菌株的体外抑菌活性。方法 分别采用 K-B 纸片琼脂 扩散法 和双纸片 增效法 检测常 见病原 菌
的耐药性和 ESBL s, 同时使用平板打孔法和改良微量稀释法 检测中 草药的体 外抑菌 活性。结 果 4种常 见病原 菌 的 23个分离 株对常用的 5类抗生素均呈现不同程度的耐药性, 其中铜绿假单胞菌的耐药谱最广, 对 14种抗生素的
activity assay of Ch inese herb m ed icine in vitro
ZHANG Chuan- liang1, L I Jin-n ian1, WANG X ing-sheng2, ZU G uo- zhang1, L I X iao- fei1, YU W e-i yi1
( 1. A nimal S cience and T echno logy College of AnH uiA gricultural University, H efei 230036, China; 2. A nhui College of T rad i-
tional ChineseM ed icine, H ef ei 230036, China ) 【Ab stract】 O b jective T o e luc idate the present drug resistant situation and resistantm echanism o f comm on patho-
ded ex tract 2 and 4 had poo r com pa tible effects, M IC were 31. 36~ 125 g /L. Conclusions 23 strains o f four k inds o f com-
m on pathogens we re a ll drug resistant stra ins, produc ing ESBL s w as one o f the m a jo r mu lt-i drug res istan t m echan ism s o f
g ens iso lated from aquatic an ima ls in A nhu,i to detect bac teriostas is ac tiv ity o f 27 kinds o f Chinese herb and 5 com pounded
ex tracts on drug resistant stra ins in v itro. M ethods K-B d isc aga r diffus ion m ethod and doub le-d isk synergy m ethod w ere
P seudom onas aerugino sa. Rh izoma cop tid is, Rheum off icinale, Flo s lon icerae and compounded extract 5 had good bac teriosta-
sis activ ity on drug resistant strains of comm on pathogens. 【K ey w ords】 A qua tic anim a ls; Pa thogens; D rug resistance; Ch inese herb m edic ine; B acteriostasis activ ity
抑菌活性, 以期为临床合理用药及中草药防治水产动 物疾病提供理论依据。
1 材料与方法 1. 1 实验菌株 拟态弧菌 4株、气单胞菌 13株、类 志贺邻单胞菌 4株和铜绿假单胞菌 2株, 均由本研究 室从患病鱼、蟹和鳖体内分离鉴定并保存。
1. 2 培养基、抗生素与中草药 MH 培养基、药敏纸 片均为杭州微生物试剂厂产品杂志 2007年 4月第 19卷第 2期
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秦皮、夏枯草、地锦草、丹皮、乌梅、连翘、黄柏、龙 胆
草、紫槿皮、诃子、败酱草、板蓝根、白头翁、马齿苋、蒲 公英、穿心莲、栀子、柴胡、苦参、苦楝皮、青蒿、大 青 叶、锦灯笼和鱼腥草 27种中草药, 均购自安徽中医医 院药房。 1. 3 常见病原菌的耐药性检测 1. 3. 1 药物敏感试验 采用 K-B 纸片琼脂扩散法, 操作方法和结果判读按美国临床试验室国家标准化 委员会 ( NCCLS) 制订的规则和标准进行 [ 3] 。分别挑 取 23株病原菌典型菌落接种 MH 培养液, 28 振荡 培养 24 h, 离心洗涤 4次, 采用平板倾注法进行活菌 计数并将细菌配成浓度为 108 CFU /m l的菌悬液。用 无菌棉拭蘸取菌液均匀涂布于 MH 琼脂平板, 室温干 燥 5 m in后, 取药敏纸片均匀贴于培养基上, 30 培 养 24 h, 观察、判读结果。 1. 3. 2 超广谱 -内酰胺酶 ( ESBL s) 检测 采用双纸 片增效法 [ 4] 。用无菌棉拭蘸取浓度为 108 CFU /m l菌 液均匀涂布于 MH 琼脂平板, 室温干燥 5 m in后, 将 头孢他啶 ( CAZ )、头孢他啶-克拉维酸 ( CDO2) 、头孢 噻肟 ( CTX) 和头孢噻肟-克拉维酸 ( CDO3) 纸片贴于 培养基上, 30 培养 18~ 24 h, 测量抑菌圈直径, 2组 中任何一组出现加克拉维酸比不加克拉维酸的抑菌 圈直径 5 mm, 则判为产 ESBL s菌株。 1. 4 中草药对常见病原菌耐药株的抑菌活性测定 1. 4. 1 中草药提取液制备 27种供试中草药各取 30 g, 分别加水 400 m l浸泡 30 m in后煎煮, 沸后文火 煮 2 h, 纱布过滤, 滤液用循环蒸发器置 70 恒温水 浴中抽气加压浓缩至 30 m ,l 使生药浓度为 1 g /m ,l 高 压灭菌后备用。 1. 4. 2 单味中草药的体外抑菌试验 从 23株常见病原 菌耐药菌株中选取 11株细菌 (拟态弧菌 4株、气单胞菌 3 株、类志贺邻单胞菌 2株和铜绿假单胞菌 2株 ), 采用平板 打孔法[ 4] 做中草药对耐药株的体外抑菌试验。用无菌棉 拭蘸取浓度为 107 CFU /m l菌液均匀涂布于 4 mm 厚 MH 琼脂板, 室温干燥 5m in后, 按图样打孔, 0. 5%无菌琼脂封 底, 每孔加中草药药液 70 ,l 30 加湿培养 18~ 24 h, 参 照文献 [ 4]判定结果, 抑菌圈直径 16 mm 为高敏, 用 S 表示; 抑菌圈直径 10~ 15 mm 为中敏, 用 I 表示; 抑菌圈 直径 < 10 mm为低敏, 用 L 表示; 无抑菌圈为不敏感, 用