负染技术、扫描电镜样品制备技术
扫描电镜标本制备技术[资料]
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扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
负染技术、扫描电镜样品制备技术
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态,室温中可升华
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
纯坎烯45oC 20min
室温,坎烯变为固体,
放入真空、升华
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min <用乙醇配制>
样品固定、脱水 中间液<醋酸异戊酯>置换
样品置入预冷的样品室 注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 <一>目的
避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 <二>方法
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面<100-
200Å > 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率<≤100Å >； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
双蒸水洗涤30min, 2%单宁酸15min×2次,双蒸水洗涤30min 1%OsO4,4oC 30min, 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥,克服表面张力的影响,保 存样品表面微细结构 1.自然干燥法
无法避免表面张力的影响,仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法
负染技术 阴性反差染色,染色剂不被样品吸收而是沉淀到
样品四周.用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞成份 的检测.
〔一染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小
2-4%磷钨酸,； 2-3%醋酸铀,pH4.2
扫描电子显微镜样品制备技术综述
扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。
SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。
扫描电镜及其制样技术
Techniques of Scanning Electron Microscope 一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法
扫描电镜技术
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种 电镜，用于观察物质表面及断面的三维形 貌 结 构 和 进 行 微 区 成 分 分 析 。
5、干燥
（1）干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂，使样品干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变形。
（2）干燥的方法
1）空气干燥法 2）真空干燥法 3）冷冻干燥法 4）临界点干燥法
（2）干燥的方法
1）空气干燥法 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水 剂自然挥发掉，以达到干燥的目的。 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许 多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。
② 临界干燥液的选择——置换液与中间液
置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液(表2)。 某些液体的临界特性 名 称 水 乙醇 氟里昂 374 243 28.9 临界温度(℃) 38 临界压力(kg/cm2) 218.5 63 表2
液体CO2 31.5 72.8
中间液：醋酸异戊酯
图3-4
临界点干燥过程
6、粘样（样品的粘贴）
（1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒 状的样品。 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成的 糊状物，用于粘贴基底部不平 整的样品。
7、金属镀膜
在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜。 （1）镀膜的目的 ① 提高样品表面的导电性。 ② 提高二次电子发射率。 ③ 减少电子束对样品的损伤。 （2）镀膜材料的选择 金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。 （3）镀膜的方法 目前常用离子溅射法镀膜。
基础实验——扫描电镜样品制备！
基础实验——扫描电镜样品制备！扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。
扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。
关于生物样品的制备，中洪医学实验君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！1样本要求扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。
但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。
1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。
3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。
4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。
对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。
2化学方法制备样品化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。
1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。
亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。
2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。
四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。
这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
11.第六章 扫描电镜样品制备技术
（2）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固 定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使 玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品 的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体 表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保 存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有 人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在－80度中 干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要 的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常 用。 （3）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味， 无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮 中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的 速度与温度成正比。
D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品 的污染。 E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。 F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。
5、粘托
样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘 到样品托上。 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件： （1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。 （2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。 （3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。 （4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。
1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
电镜样品基本制备方法第二节负染色技术
（四）样品的均匀分散性 在进行负染时，经 常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂 与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清 样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是 悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现 象。
电镜样品的基本制备方法
第二节 负染色技术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度 的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如 磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在 黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结 构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄 切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制， 目前还不够清楚。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把 带滤纸吸干铜网上的多余悬液， 再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最 后再用滤纸将染液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的悬液将 要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬 液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色 效果，便得不到理想的负染电镜图像。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀 浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离 心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎 片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温 超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸 （PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、 醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷 钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5 ％～3％的溶液，染色前应用：
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及 疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再 将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍 干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊 断．
电镜样品基本制备技术之负染色技术
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）漂浮法 先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
四、影响负染效果的有关因素 （—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
这样微波能便转变成分子的随机动能，并产 生了瞬间热使组织得以均匀加热。上述这种高速 的分子运动，又促进了组织内化学试剂的扩散， 并增强了与组织的结合；而且，在高速分子运动 和碰撞中，完成了化学反应和平衡。
以上只是微波辐射制样技术的初步原理，相 信随着该技术的应用和逐渐成熟，一定会对其作 用机理会有更确切、完美的解释。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。
然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。
下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。
1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。
该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。
该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。
2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。
这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。
它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。
3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。
这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。
4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。
该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。
总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。
每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。
扫描电镜样品制备
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
实验十一 扫描电镜样品制备
选作
扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌 、割裂面结构、管腔内表面的结构等。
一、扫描电镜工作原理：
主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质 的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。
5. 置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合 液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液， 加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
扫描电镜测试生物样品制备技术.
扫描电镜测试生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分,而且比较柔软,因此,在进行扫描电镜观察前,要对样品作相应的处理。
扫描电镜样品制备的主要要求是:尽可能使样品的表面结构保存好,没有变形和污染,样品干燥并且有良好导电性能。
一.样品的初步处理(一取材样品面积可为8mm×8mm,厚度可为5mm。
对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,可固定在滤纸或卡片纸上,以充分暴露待观察的组织表面。
(二样品的清洗用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面,即组织的游离面。
由于样品取自活体组织,其表面常有血液、组织液或粘液附着,这会遮盖样品的表面结构,影响观察。
因此,在样品固定之前,要将这些附着物清洗干净。
清洗的方法有以下几种:1.用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;2.用5%的苏打水清洗;3.用超声震荡或酶消化的方法进行处理。
例如清洗肠粘膜表面的粘液,可用下面的方法:清洗液配方:透明质酸酶300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5~6。
清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中,边浸泡边震荡30分钟,最后用双蒸水洗3次。
无论用哪种清洗方法,注意在清洗时不要损伤样品。
(三固定固定样品的常用试剂为戊二醛及锇酸双固定。
由于样品体积较大,固定时间应适当延长。
也可用快速冷冻固定。
(四脱水样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水,然后进入中间液,一般用醋酸异戊酯作中间液。
二.样品的干燥扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。
无论是水或脱水溶液,在高真空中都会产生剧烈地汽化,不仅影响真空度、污染样品,还会破坏样品的微细结构。
因此,样品在用电镜观察之前必须进行干燥。
干燥的方法有以下几种:(一空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法,就是将经过脱水的样品,让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。
这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中,组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程因为透射电镜能察看的样品一定很薄（ 60～ 70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单调，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单迅速，能够显示生物大分子、细菌、分别的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、构造、大小以及表面构造的特点。
特别在病毒学中，负染色技术有着宽泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，可是假如杂质太多，如大批的细胞碎片，培育基残渣，糖类以及各样盐类结晶的存在都会扰乱染色反响和电镜的察看。
特别是不可以有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类简单碳化而有碍察看，所以样品要适合提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品聚积影响察看。
操作流程：汲取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，而后用滤纸吸去剩余的液体，滴上负染色液，染色1～2min 后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜察看。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜察看供给薄样品的特意技术，是生物学中研究细胞超微构造最常用的技术。
宽泛应用于生物体的各样细胞的超微构造察看。
一般厚度在10～100nm 的切片称为超薄切片，制作这类切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包含取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的白腊切片过程相像。
可是，超薄切片切片过程更加仔细与复杂，要求更严格，并且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
详细操作步骤、注意事项以下：1．取材和前固定：迅速的切取大小为0.5～1.0mm3 的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入 2.5％戊二醛（入口质量）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前必定要和工作人员获得电话联系！②取材选择部位要正确靠谱，保证每块资料都是要察看的部位。
③全部植物样品必定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空 15mins，不可以沉底的样品必定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不可以成块的样品，加戊二醛固定液，离心积淀后送到平台，由平台工作人员办理。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术PPT课件
对于具有生物活性的样品，负染色技 术需要在保持样品活性的前提下进行。 因此，需要在制备过程中采取适当的 措施，如使用稳定剂或保护剂，以保 持样品的生物活性。
涂膜的均匀性与稳定性
均匀性
在负染色技术中，涂膜的均匀性对电镜观察效果至关重要。涂膜应均匀覆盖样品表面， 避免出现涂层不均、颗粒等现象。为保证涂膜的均匀性，可采用旋转涂膜、多次涂覆等
浓度控制
染色液的浓度对染色效果和样品稳定性有重要影响。在负染色技术中，应精确控制染色液的浓度，以 确保染色效果最佳且不损伤样品。同时，还应根据实际情况调整染色液的浓度，以获得最佳的观察效 果。
观察条件的选择与优化
观察条件
负染色技术的观察条件包括电镜的加速电压、工作距离、物镜光圈等参数。这些参数的选择直接影响观察效果和 样品的成像质量。在观察过程中，应根据样品的性质和特点选择适当的观察条件，并进行优化调整。
应用领域与优势
应用领域
负染色技术广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域，如病毒、细菌、细胞、 蛋白质等生物大分子的结构和形态研究。
优势
负染色技术具有操作简便、分辨率高、样品制备时间短等优点，能够清晰地呈 现出样品的形态和结构，为科学研究提供重要的实验依据。
02
负染色技术的基本步骤
样品准备
选取适当的样品
细菌和微生物研究
在细菌和其他微生物的研究中，负染色技术也发挥了重要作用。通过负
染色，可以观察细菌的形态、排列和细胞壁等结构特征，有助于细菌鉴
定和分类。
03
蛋白质和核酸研究
负染色技术也可用于观察蛋白质和核酸等生物大分子的结构和形态。通
过负染色，可以观察到大分子的形状、大小和分布情况，有助于理解其
功能和作用机制。
扫描电镜样品制备技术教学
1 常规样品制备技术 2 冷冻割断技术 3 离子蚀刻技术 4 铸型技术 5 聚焦离子束技术
扫描电镜是研究样品的表面结构， 要求样品的表面不变形、无污染、导电 好、干燥好，结构清晰、无损坏。
对于金属样品或较硬的组织来说样
品处理比较简单。对于生物的软组织来 说，就需要进行较为复杂的样品处理过 程。
5×5×3mm3为 宜。
2 清洗 对要观察的组织表面用缓冲液
或生理盐水进行快速冲洗，除掉表面 的粘液、组织液、血液等附着物，尽 量将组织表面清洗干净，以利于电镜 观察。对于载玻片上的培养细胞要注 意冲洗力量，防止细胞脱落。对于难 以冲掉的附着物，也可在固定后仔细 冲洗。
3 固定 将清洗好的组织迅速放入2%戊
冰冻干燥法： 乙醚，液氮冷冻，真空干燥。
乙腈真空干燥法： 脱水后的组织进行50%，70%， 90% ，100%乙腈置换，各15分钟， 然后放入真空镀膜台的膜：
离子镀膜（溅射镀膜）：
其他样品制备方法
1 冷冻割断法： 2 离子蚀刻法： 3 铸型技术： 4 离子聚焦束IFB
下面主要介绍生物组织的样品制备 技术。
生物样品的常规处理方法
1 取材 2 表面结构的清洗、暴露 3 组织固定 4 组织脱水 5 组织干燥 6 组织表面导电处理 7 组织干燥保存
1 取材 取材速度要快，刀片要锋利，
避免组织挤压，将要观察的区域 用刀片切开暴露，组织块可大至 40×4 0×10mm3,一般
二醛固定液中2小时，0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟，然后放入 1%的锇 酸中后固定液1小时， 0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟。
4 组织脱水
固定好的组织清洗后用 酒精或丙酮进行梯度脱水， 30%， 50%，70%， 90%， 100%各15分钟。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备3.1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。
如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。
和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。
在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。
扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。
但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。
扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。
②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。
③试样表面一般起伏（凹凸）较大。
④观察方式不同，制样方法有明显区别。
⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。
上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。
在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。
3.1.1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。
这类材料的试样制备最为简单。
只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。
但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。
②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。
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50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min (用乙醇配制) 立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华
5.临界点干燥法 干燥效果最好，应用最广泛 ⑴原理 物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也 可复相存在。 临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面 张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。 液态CO2临界温度：31.5oC，临界压力72.8kg/cm2
(二) 游离细胞 收集所需细胞 PBS洗涤，1000rpm 5min,弃上清 滴入2-4ml 0.5%戊二醛，4oC 0.5h
适量0.1%多聚赖氨酸
4×6 mm玻片,室温5-10min 吸去多余液体,成膜
PBS洗涤，1000 rpm 5min,弃上清，制成悬液
膜未干
细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体 1%戊二醛，4oC 1h PBS漂洗，1%OsO4，4oC 1h，梯度酒精脱水
（三）欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用“割断法”暴露观察部位 1.常用的割断法 二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法 2.冷冻割断的操作 TF-1冷冻割断仪 简易割断器 注入液氮 固化包埋 割断 溶化冲洗
3.标本制作法
取 材 (1×1×5mm) 、 前 固 定 (1%OsO4 ， 4oC 1h) 浸 洗 (0.1M PBS ， 10min×3次 ) DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min) 冷冻割断 后固定(0。1%OsO4，4oC 30min) 双 蒸 水 洗 涤 30min ， 2% 单 宁 酸 15min×2 次 ， 双 蒸 水 洗 涤 30min 1%OsO4，4oC 30min， 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少 3.导电染色法/组织导电技术(TOT) 利用金属盐(碘化甲、单宁酸)对生物体蛋白质、脂肪 的结合作用
扫描电镜生物样品制备的基本程序
用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，镜检 (三) 影响因素
1.被检样品纯度和浓度
2.染色液pH
3.操作技巧
扫描电镜生物样品制备技术 含水量少的组织(骨骼、牙齿、毛发等) 预处理、导电 含水量多的组织(大多数组织) 预处理、 干燥、 导电 一 样品预处理 (一)常规样品 1.取材 5×8 mm， 保护观察面 2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗，快！ 3.固定、脱水 同超薄切片
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥，克服表面张力的影响， 保存样品表面微细结构 1.自然干燥法 无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法 样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态，室温中可升华 标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min 纯坎烯45oC 20min 室温，坎烯变为固体， 放入真空、升华 4.乙腈干燥法 标本预处理
⑵方法
样品固定、脱水 中间液(醋酸异戊酯)置换 样品置入预冷的样品室
注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 (一)目的 避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 (二)方法 1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100200Å) 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率(≤100Å)； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
负染技术 阴性反差染色，染色剂不被样品吸收而是沉淀 到样品四周。用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞 成份的检测。 （一）染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小 2-4%磷钨酸，pH6.4-7.0； 2-3%醋酸铀，pH4.2
（二）操作方法 待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10 min 用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干 滴染色液，染色3-5min