流感病毒实验室检测PPT课件

– 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) – 正反向引物 (40μM) – 双重标记探针(10μM)
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 • 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测
程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测
◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养
◆胶体金快速检测
荧光定量PCR
• 引物和探针
– 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； – 涡旋振荡引物和探针； – 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
• real-time RT-PCR的试剂
– QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443
荧光定量PCR
• 第一次使用前引物稀释
• 1．引物工作浓度（40μM） • 配制方法：
– （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的 量为9.1 nmol ，加水量为10×9.1＝91μl） – （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。
• 采集时间：病人发病的头3天内采集 • 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院 • 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家 哨点医院每周至少采集5～15份流感样病例的 标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时 调整）
暴发疫情标本采集
• （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； • （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。 用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
பைடு நூலகம்
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
• 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保 持低温。
荧光定量PCR
• 反应体系和条件
• 试剂：Invitrogen SuperScript® III Platinum® One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen， 货号：11732-020或11745-100）
检测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
核酸检测
• 核酸提取- QIAamp® Viral RNA Mini Kit • 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 ％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 • 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 • 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。
• 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。
采集标本类型
常规
咽拭子 鼻拭子 痰液
特殊
鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或 MEM； • 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250μg/mL ）
• 2．探针工作浓度（10/20μM/） • 配制方法：
– （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。 – （3）将100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。
流感病毒实验室检测
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； • （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测
• （二）流感样病例暴发疫情监测
流感样病例监测标本采集
• 采集对象： 流感样病例
发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者
咽拭子采集
• 咽拭子 • 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料 杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉 签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃 去，旋紧管盖。
标本的保存与运送
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
• 未能送至实验室的，应臵-70℃或以下保存， 一周内送实验室 • 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室