关于细胞培养中的污染
细胞培养中的几种污染
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胞培养中的污染分为两类,化学污染和生物污染。
化学污染化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。
这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。
化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。
它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质,对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。
细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子,对细胞生长和实验结果产生影响。
细菌内毒素是临床上的最主要的热原(即注射到动物体内会导致动物发热),所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。
生物污染生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染,和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。
细菌、霉菌和酵母到处存在,它们能在合适的环境中非常快速的生长。
这些污染比较容易观察到,它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化,或者通过显微镜观察就可以看见。
由于病毒有种属特异性,所以病毒污染的概率比较小。
但是病毒污染难于发现,因为病毒颗粒特别微小,一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。
由于病毒一般潜伏在细胞内,对整个细胞培养不是致死的,所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。
1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。
90年代初美国的一个调查发现,在该国的细胞培养中,至少有15%被支原体污染。
由于支原体没有细胞壁,在细胞培养液中几乎是透明的,同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感,不引起 pH 变化,不使培养液浑浊,所以支原体污染不容易被发现,但是其存在会影响实验的结果。
细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象:1981 年对ATCC细胞株的调查显示:超过 60 标记为其他细胞株的细胞居然是 HeLa 细胞。
细胞培养中的污染问题与对策
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细胞培养中的污染问题与对策细胞培养是一种常见的实验室技术,用于研究细胞的生长、分化和功能。
然而,在进行细胞培养的过程中,污染是一个不可忽视的问题。
污染源可以来自外部环境、工作环境或实验操作不当。
对于细胞培养的研究结果的准确性和有效性而言,解决污染问题的对策至关重要。
首先,污染问题可能来自实验室环境以及操作者自身。
实验室环境中存在的微生物污染可能会导致细胞培养的受损。
因此,保持实验室环境的清洁是非常重要的。
定期进行实验室卫生和表面消毒是降低微生物污染的有效措施。
此外,操作者在进行细胞培养时需要严格遵守无菌操作规程,以减少自身的污染对细胞的影响。
操作者需要穿戴合适的实验室清洁工作服、手套和口罩,并在操作过程中注意避免直接接触细胞培养物。
其次,细胞培养中使用的培养基和试剂也是潜在的污染源。
为了避免污染,选择高纯度的培养基和试剂是至关重要的。
购买来自可靠供应商的培养基和试剂,严格遵循使用说明书的指导,可以减少产品本身的污染。
此外,在实验进行过程中,避免将培养基和试剂暴露在不洁的环境中,并妥善保存这些试剂,以防止其受到污染。
另外,细胞培养过程中的传代也是容易导致污染的环节。
细胞传代是保持细胞生长的关键步骤,但传代时的细胞污染可能会导致细胞功能和表型的变化。
为了避免细胞污染,应该定期对细胞进行鉴定和检测,特别是使用发展中的分子标识技术。
这些技术可以帮助确定细胞是否保持纯种,以及是否受到污染。
此外,定期保存冻存品库并且用来传代的细胞不要超过特定的传代次数,以保持细胞的良好生长状态。
另一个需要关注的污染问题是培养器具的污染。
培养器具包括培养皿、培养瓶、移液器等。
这些器具在使用之前需要经过高温高压灭菌处理,以确保其无菌状态。
在使用过程中,需要注意避免直接接触器具内外部分,以减少污染的可能性。
同时,定期更换使用的培养器具也是非常重要的,以防止积累污染物。
最后,除了以上提到的对策,培养载体选择也可以在一定程度上减少细胞培养时的污染问题。
细胞培养污染的途径、危害及预防措施
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细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。
由于每一种细胞有其独特的培养体系,因此污染造成的后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉和检测,而且污染源能长期共存于培养体系中,这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为一个生物体,会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应,造成培养细胞生物学特性的改变,而对实验结果造成潜在的威胁,而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。
由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢,因此生物性的污染对细胞的危害最大。
随着污染微生物的不断增殖,交叉污染的可能性也不断增加。
此外,微生物代谢消耗大量必需的养分,同时产生多种有毒的代谢产物,如酶、抗原及毒素等,进一步对细胞产生毒害作用。
因此,熟悉细胞培养污染的途径及其危害性,建立细胞培养规范的操作方法及规章制度,可以有效地防止污染,保证实验体系的稳定性和可靠性。
1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响,必须建立细胞冻存库。
细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库,当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。
每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。
同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定[1]。
为了保证培养细胞系的完整性,必须进行具体的实验记录,应包括以下内容:细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。
具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。
经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比,随着培养时间的延长,细胞在适应环境的过程中,其生物特性已发生了改变。
培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。
随着培养时间的延长,生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势,这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。
应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。
细胞培养中常见的污染的处理
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细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下:1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。
孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。
,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
如何预防细胞培养污染问题
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如何预防细胞培养污染问题细胞培养是生物学和医学研究中常用的一种技术方法,但细胞培养过程中常常会面临细胞污染问题。
细胞培养污染会严重影响实验结果的准确性,因此需要采取一系列措施来预防细胞培养污染。
本文将介绍几种常见的细胞培养污染问题以及预防措施。
1. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
来自操作人员、试剂、培养器具和工作环境等多方面的细菌污染都可能导致细胞培养中的细菌污染。
预防措施:•穿戴合适的实验服和手套,并进行消毒处理,减少操作人员带入的细菌污染。
•使用无菌、高质量的试剂,并在实验中进行常规无菌操作,保持培养器具的无菌状态。
•经常对实验室进行清洁和消毒,保持工作环境的无菌。
2. 真菌污染真菌污染是细胞培养中另一个常见的问题。
真菌往往来自环境中的空气、试剂、培养器具或操作人员。
真菌污染会导致细胞生长异常,细胞死亡或实验结果异常。
预防措施:•定期消毒工作环境,特别是操作台和培养箱,避免真菌的滋生。
•使用高质量的培养基和抗生素,抑制真菌的生长。
•采取无菌技术操作,减少操作人员带入的真菌污染。
•定期更换培养器具,特别是培养瓶和培养皿,避免真菌滋生。
3. Mycoplasma 污染Mycoplasma 污染是细胞培养中常见但容易被忽视的问题。
Mycoplasma 是一类细小的细菌样微生物,常常会导致细胞株的污染。
Mycoplasma 污染会影响细胞生长、代谢以及实验结果的可靠性。
预防措施:•定期检测细胞株的 Mycoplasma 污染情况,可以使用 PCR 或流式细胞术等方法进行检测。
•新购买的细胞株进行隔离培养,并进行 Mycoplasma 检测,确保细胞株的无菌性。
•严格控制培养器具、培养基和操作人员的无菌操作,减少Mycoplasma 污染的可能性。
•定期更换培养基并添加抗生素,可以抑制 Mycoplasma 的生长。
4. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中,不同细胞株之间发生的细胞混合现象。
细胞培养中的常见问题解决方法
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细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而,细胞培养过程中常常会遇到一些问题,例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题,可以采取以下几种方法:- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件,包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常,请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说,添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段,但在细胞培养过程中,过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少,对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法:- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期,避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求,并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述,细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染,继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议:- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定,及时调整pH值,保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中,需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养技术中常见污染问题的解决方法
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细胞培养技术中常见污染问题的解决方法细胞培养技术在生物医学研究领域扮演着重要的角色。
然而,细胞培养过程中常常会出现一些污染问题,严重影响实验结果的可靠性和重复性。
本文将探讨细胞培养技术中常见污染问题的解决方法。
一、细菌污染在细胞培养过程中,细胞培养器皿、培养基和实验室环境中都可能存在细菌污染的问题。
为了解决这个问题,可以采取一些预防措施。
首先,必须定期清洗和消毒培养器皿,以确保其表面的无菌。
其次,使用高品质和无菌的培养基是防止细菌污染的关键。
培养基应在严格无菌条件下配制,并在每次使用前进行相关的质检。
此外,实验室环境的洁净度也需要保持,经常进行清洁和消毒,减少细菌的滋生和传播。
二、真菌污染真菌污染是细胞培养中常见的问题之一,尤其在湿度高的环境下更容易发生。
为了避免真菌污染,可以在实验室中合理控制湿度,并保持培养器皿和培养基的干燥。
此外,使用抗真菌剂可以有效地减少真菌感染的风险。
对于一些特定的细胞系,可以对细胞培养器皿进行预处理,如用乙醇或己硝酸等消毒剂进行表面处理,以提高培养器皿的抗真菌能力。
三、交叉污染细胞系的交叉污染是实验室中常见的问题。
它可能是由于不慎携带其他细胞系的污染物,或是在培养中不同细胞系之间的相互感染所致。
为了防止交叉污染,可以采取一些措施。
首先,实验人员在操作细胞系之前必须养成良好的个人卫生习惯,包括洗手、戴手套等。
其次,不同细胞系之间要严格分开培养,避免接触。
此外,可以对新获得的细胞系进行鉴定,使用PCR等方法进行验证,确保其纯度。
四、内源性污染内源性污染是指细胞系自身产生的污染物。
它可能是由细胞自身分泌的代谢产物、去胎氧核糖核酸或细胞死亡引起的。
为了解决这个问题,可以采取以下措施。
首先,要定期更换培养基和培养器皿,及时清除废液和死细胞。
其次,对细胞进行经常性的鉴定,确保其活性和稳定性。
同时,培养温度、培养时间等因素也需要加以调整,以减少内源性污染的发生。
综上所述,细胞培养技术中常见的污染问题是可以通过一系列的控制措施来解决的。
细胞培养中常见污染
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最近看到不少问有关细胞培养污染的事,正好我看到了一个有关这方面的总结,很全很好很强大,跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下:1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。
孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。
,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。
细胞培养中的常见问题及解决方法
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细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一,可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。
然而,细胞培养过程中常常会出现一些问题,如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。
本文将讨论细胞培养中的这些常见问题,并提出相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。
它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。
细胞污染会影响实验结果的准确性,并可能导致细胞系的丢失。
为了解决这个问题,我们可以采取以下措施:(1)经常检查细胞培养器具和培养基,确保其无菌;(2)使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理,以减少污染的风险;(3)定期进行污染检测,例如细胞培养液和工作区的表面。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分,但在细胞培养中,过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。
为了减少细胞凋亡的发生,我们可以考虑以下措施:(1)优化培养条件,包括温度、CO2浓度和培养基配方等;(2)定期检查细胞形态和健康状况,及时处理出现凋亡现象的细胞;(3)使用细胞凋亡检测工具,如Annexin V-FITC/PI染色法,来评估细胞凋亡水平。
3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生,可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。
为了避免细胞失活的发生,我们可以尝试以下方法:(1)及时更换培养基,确保细胞获得充足的营养物质;(2)避免过度培养,及时传代细胞;(3)定期鉴定细胞的纯度和活力,并确保培养条件适当;(4)尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。
细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个,还有其他一些问题,例如细胞出现突变、细胞凝固等。
针对这些问题,我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。
同时,注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。
细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。
了解并解决细胞培养中的常见问题,有助于提高实验结果的准确性和可重复性。
通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择,我们可以克服这些问题,为细胞培养研究的进展做出贡献。
培育技术中常见的细胞污染处理方法
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培育技术中常见的细胞污染处理方法细胞污染是培育技术过程中一个常见而严重的问题。
细胞污染指的是外源性的微生物、真菌、细菌或其他细胞种类在细胞培养中的存在。
细胞污染会对实验结果产生不可预测的影响,甚至使实验失效。
因此,对于细胞污染的处理方法和预防措施的研究非常重要。
本文将介绍一些在细胞培养中常见的细胞污染处理方法。
一、消毒剂处理消毒剂处理是最常见的细胞污染处理方法之一。
消毒剂可以有效杀灭微生物和其他细胞种类,以减少污染。
常见的消毒剂有乙醇、过氧化氢和氯化物等。
在使用消毒剂处理细胞污染时,应选择适当的浓度和处理时间,并确保消毒剂不会对目标细胞产生不良影响。
二、培养基更换培养基更换是另一种常见的细胞污染处理方法。
培养基中添加抗生素可以有效抑制污染微生物的生长。
常用的抗生素包括青霉素、链霉素和庆大霉素等。
更换含有抗生素的培养基可以杀灭或抑制细菌和真菌等微生物的生长,从而有效处理细胞污染。
三、细胞分离细胞分离是一种通过分离感染的细胞来处理细胞污染的方法。
这可以通过细胞离心、细胞分选或免疫磁珠分离等技术来实现。
通过分离感染的细胞,可以有效减少细胞污染,同时保留无污染的细胞进行后续实验。
四、细胞冻存细胞冻存是另一种有效处理细胞污染的方法。
将无污染的细胞分装入液氮等低温环境中冻存,可以有效抑制细菌、真菌和其他细胞种类的生长。
在需要时,可以从冻存样品中恢复细胞,以继续实验。
然而,细胞冻存也存在一定的风险,如细胞冻存过程中可能引起的细胞损伤等问题需要注意。
五、污染原因的分析和改进污染原因的分析和改进是细胞污染处理的重要环节。
通过分析细胞污染的原因,可以采取相应的改进措施来预防细胞污染的再次发生。
污染原因的分析可以包括对实验设备、试剂和操作流程等的检查和评估。
通过对可能存在的问题进行改进,可以有效提高细胞培养的纯度和可靠性。
细胞污染是培育技术中一个常见且严重的问题。
为了有效处理细胞污染,研究并应用适当的处理方法和预防措施是非常重要的。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
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细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下:1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。
孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。
,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。
细胞污染的种类有哪些
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细胞污染的种类有哪些1. 异物污染细胞培养的一个常见问题是异物污染。
异物污染是指在细胞培养过程中,由于一些外部因素导致培养器具或培养介质中出现的异物。
这些异物可能包括灰尘、纤维、酵母、细菌、真菌、病毒等。
这些异物不仅会干扰细胞的生长和功能,还可能引起未知的变化和不确定的结果。
因此,在进行细胞培养实验时,要特别注意避免异物污染。
2. 细胞污染细胞污染是指在细胞培养的过程中,细胞本身受到一些外部因素的污染,从而导致细胞的变异、功能受损甚至细胞死亡。
细胞污染可以由以下几种常见的污染源引起:a. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的污染之一。
常见的细菌污染源包括实验环境中的空气、实验器具、培养介质等。
细菌污染会导致细胞生长受阻、感染和细胞凋亡等,严重时甚至会使细胞无法继续培养和使用。
b. 真菌污染真菌污染是指一些真菌,如酵母菌等进入细胞培养环境中并污染细胞。
真菌污染会引起细胞外观的改变、生长受阻、功能受损等问题。
在细胞培养实验中,应特别注意真菌污染的防控。
c. 病毒污染病毒污染在细胞培养中较为罕见,但一旦发生,对细胞的影响极大。
病毒污染会导致细胞的变异、功能失调甚至细胞死亡。
因此,进行细胞培养实验时,必须定期进行病毒检测,并采取相应的防控措施以避免病毒污染的发生。
d. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中,细胞株之间或批次之间发生的互相污染。
细胞培养实验室中经常同时进行多个细胞系的培养,因此,交叉污染的风险也相应增加。
交叉污染会导致细胞株的混杂和受污染细胞株的功能异常。
为了避免交叉污染,实验室应有严格的实验室操作流程,并定期检测细胞株的纯度。
3. 其他污染除了以上几种常见的细胞污染,还有一些其他类型的污染也可能影响到细胞培养实验的结果,例如:•化学物质污染:来自培养介质、溶液、培养基等中的化学物质可能对细胞产生毒性影响,导致细胞的变异或死亡。
•辐射污染:细胞培养过程中可能存在来自辐射源的污染,这可能会对细胞的遗传物质和生理功能产生不可逆的损害。
关于细胞培养中的污染
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细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下:1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。
孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml 的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。
,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/mlTylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞培养常见细菌污染原因
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细胞培养常见细菌污染原因细胞培养是生物学研究中常用的实验技术,用于研究细胞的生理、生化和分子生物学特性。
然而,细胞培养过程中常常会受到细菌污染的影响。
细菌污染会对细胞培养的可靠性和准确性产生不良影响,因此控制细菌污染是细胞培养实验中至关重要的一步。
细胞培养常见的细菌污染原因主要有以下几个方面:1. 操作不当:细胞培养的整个过程都需要严格的无菌操作,而操作不当是导致细菌污染的主要原因之一。
无菌操作包括更换培养基、移液操作、接种细胞等,如果在操作过程中没有严格遵守消毒和无菌操作规范,就会导致细菌的进入和繁殖。
2. 试剂和培养物污染:试剂和培养物是细胞培养中常用的重要物质,如果试剂和培养物本身存在细菌污染,那么在培养过程中就会引入细菌。
试剂如培养基、酶、胎牛血清等的批次变化或不良质量,都可能导致细菌污染。
此外,非无菌的操作也会导致试剂和培养物的污染。
3. 实验室环境污染:实验室环境中存在微生物的存在,如桌面、空气、实验器皿等都可能存在细菌。
如果实验室的环境清洁度不够高,容易造成细菌污染。
此外,实验器皿如培养皿、离心管等的洗涤和保存也需要保证无菌操作。
4. 人员因素:人员的操作能力和操作习惯也会影响到细菌污染的发生。
操作人员应该保持良好的个人卫生习惯,定期对手套、实验服等进行更换和清洗。
如果操作人员不注意操作细节,如不合理的移液操作、使用不干净的仪器等,都可能导致细菌的污染。
5. 培养器具污染:培养器具如试管、离心管、细胞培养板等在使用之前需要经过高温和化学消毒处理,以杀灭其中潜在存在的细菌。
然而,如果器具处理不彻底或者保存环境不好,就容易导致细菌的残留或再次感染。
细胞培养中细菌污染的危害是非常严重的。
首先,细菌污染会干扰细胞培养体系的稳定,导致无法准确观察和研究细胞的生理和生化特性。
其次,细菌代谢产物和细胞培养物中含有的抗生素等成分会干扰细胞培养的正常生长和发育,降低实验结果的可靠性和准确性。
此外,由于细菌的存在,还容易导致细胞死亡和污染的蔓延,对细胞培养的连续性和稳定性造成不可逆的伤害。
细胞培养的污染
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支原体污染:是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。是 细胞培养研究中重点预防对象。 (1)支原体生物学性状:一种介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小 微生物。可通过除菌滤器。 多形态性,光镜下难以看清其结构。 多吸附于细胞表面或散在细胞之间。 对青霉素普遍有抗药性。
(2)对细胞的影响:多数细胞受污染后,无明显变化,或有微细变化却由于 传代和换液而被缓解。
化学性污染的来源、危害及预防
培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑 制细胞的生长,某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学
物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因 子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分, 如氨基酸,若浓度超过了合适的范围,也会对细胞产生毒性。玻璃制品清洗 过程中残留的变性剂或肥皂是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时 膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水 的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分 子、细胞内毒素等物质对水的污染,在配制液体,清洗容器时必须使用不含 杂质的超纯水。需要注意的是,超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气 灭菌及蒸馏水时水经常被污染,因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能 有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度,我们应采取措施尽量避免化学 物质的残留。
2、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细, 并在无菌试验阴性后才能使用。
3、操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
4、 防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分。
在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,
细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法
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细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法细胞培养是生物学研究中经常使用的一种重要技术手段。
然而,随着研究的深入,细胞培养中常常会遇到细胞污染的问题,这给实验结果的可靠性和准确性带来了很大的影响。
细胞污染主要包括细菌、真菌、酵母、病毒以及其他的微生物污染。
在细胞培养中,如何及时发现和处理细胞污染问题,是每个实验室都需要面对的重要课题。
细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
造成细菌污染的原因有很多,比如培养器具不洁净、操作不规范等。
当出现细菌污染时,可以通过观察培养物的外观变化来初步判断是否受到污染,比如培养物颜色的改变、气泡的形成等。
如果存在细菌污染的症状,可以通过将培养物进行细菌培养或细菌PCR检测以确认。
一旦确认细菌污染,需要立即更换培养器具,重做培养基,并对培养箱等设备进行彻底清洁和消毒。
真菌和酵母的污染在细胞培养中也是相对较常见的问题。
真菌和酵母污染一般表现为培养物的颜色变化、膜片上出现菌丝等。
当怀疑存在真菌和酵母的污染时,可以将培养物进行不同培养基上的转接和形态学观察,也可以通过真菌和酵母的特异性培养基进行检测确认。
处理真菌和酵母污染的方法包括体外灭菌、常规抗生素处理、加入抗真菌和酵母的药物等。
另外,病毒是一种较为严重的细胞污染问题。
病毒感染可以导致细胞凋亡、细胞功能紊乱甚至细胞死亡。
常见的病毒污染有常见冷感冒病毒、乙肝病毒等。
病毒污染的判断往往需要通过病毒培养、PCR或ELISA等技术进行鉴定。
处理病毒污染可以采用病毒灭活剂或直接更换细胞系等方法。
除了微生物污染外,还存在一些其他的细胞污染问题。
比如,细胞交叉污染是指来自其他细胞系的细胞误将自己的培养物中。
为了避免细胞交叉污染,可以采用细胞系的DNA指纹鉴定技术,或者使用经过认证的培养物,同时加强无菌操作的培养。
总结起来,细胞培养中的细胞污染问题多种多样,但我们可以通过细心观察培养物的变化、培养基的转接和不同培养基的形态学观察、特异性培养基的检测以及分子生物学方法的应用等,及时发现和处理细胞污染问题,确保实验的可靠性和准确性。
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细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下:1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。
孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。
预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D 或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。
,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
4、黑蛟虫:可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。
常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。
建议如果细胞有可能是此种污染的话,可以增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率。
5、真菌:一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片,只是它很多很多的小块很清楚,象珊瑚状,不象细胞碎片分不清,慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了。
6、原虫:培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。
他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。
这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环。
7、污染的可能原因:可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等关于培养基的无菌状况,取培养基至培养瓶中(不加细胞),37度试培养一段时间后观察。
如果没有细菌生长就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗(硫酸链霉素和氨苄青霉素)。
但双抗有时会影响细胞的状态,所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗,以避免影响实验结果。
1、孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射,并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素3、超净台的风机不能过大,风机到6-8格。
否则也可能能致霉菌污染4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后,可用同等量的氨水喷洒中和,约几小时即可进入操作。
污染是细胞培养第一大害!不过好像一般普通培养真菌污染的概率比较大些,因为培养基中常会加入细菌抗生素。
关于“黑胶虫”或“黑蛟虫”或“黑焦虫”的性质或本质,有谁能提供点资料么?比如生物学分类,生活习性,结构形态,高倍镜或电镜图片。
另外,有英文相关文献么?至少名字有英文的么?有人研究这种“虫子”或“微生物”或“纳米级细菌”么?我们实验室这段时间经常污染。
在低倍镜下观察,是很多黑色的小点,在高倍镜下,发现黑色小点在原地轻微的颤动,这是黑胶虫吗我的细胞也怀疑是黑胶虫污染,但是否经空气传播?因为同一培养箱中有的细胞中,高倍镜下可见小黑点游动,有的就没有,且黑点会长成黑虫关于黑胶虫:根据平时的操作,我觉得“黑胶虫”有没有可能是以下操作细节方面的问题导致的呢?1、有时候血清瓶或者培养瓶上用标记笔写的字没有擦掉就直接泡酸,字迹溶解后沉积在酸缸中浸泡的瓶子里冲洗不净。
2、过火的时候不小心碰到酒精灯的灯芯,粉尘飞进培养液内。
3、有的同学习惯将移液管塞棉花的一端在酒精灯上焚烧一下,灰烬飞进培养液内。
请教!我们实验室就曾经利用制霉菌素制服过真菌污染,拯救了细胞,回想起来真是"惊心动魄"啊!看贴后,我怀疑我的杂交瘤被霉菌污染了.24孔板中央老是有絮状物,细胞没死,但生长不佳.将絮状物吸出后,第二天又有.并且将细胞裹在里面生长.请问这样的瘤细胞能不能上腹水.我培养基里都加了双抗,刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好,但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着,瓶底还是有贴壁的细胞,细胞培养基混浊,开始以为是细胞长得太多,导致接触抑制死亡,但是倒掉培养基,用PBS洗干净,把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后,第二天还是出现这种情况。
有时如果传代的细胞特别少,每天给他换液,到了第三天左右,细胞数目不多,但也出现了上述的情况(很多碎片和团状物飘着),不知大家有没有遇到这种情况,帮忙分析分析。
谢谢!(我养的都是肿瘤细胞)培养液味道变臭了应该是厌养菌污染.我培养基里都加了双抗,刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好,但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着,瓶底还是有贴壁的细胞,细胞培养基混浊,开始以为是细胞长得太多,导致接触抑制死亡,但是倒掉培养基,用PBS洗干净,把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后,第二天还是出现这种情况。
有时如果传代的细胞特别少,每天给他换液,到了第三天左右,细胞数目不多,但也出现了上述的情况(很多碎片和团状物飘着),不知大家有没有遇到这种情况,帮忙分析分析。
我也有同样问题,我现在也出现了类似的情况有可能是支原体污染曾经做单抗铺巨噬细胞,铺好发现细胞全是会动的,跑的还挺快!!仔细一看,全是滴虫。
感情这只老鼠感染了滴虫!!!!我那个郁闷阿!我的细胞污染探索某天打开孵箱,看到我的L1210的培养瓶培养液又是黄黄的,觉得很不错,今天又可以传代了,可是在镜下一看,细胞虽然明显增加了,但并没有象以前那样长满,而且更让我心惊的是怎么出现了许多黑色的小点,杆状,而且好像在动来动去,翻转,旋转,在细胞很多的地方小点就少,而在细胞较少的地方小点就多,细胞的活力也没有以前好了,第一反应细菌污染,请实验室老师过来看,说不是细菌污染,这个点要比细菌的小黑点大的多,也好象不是霉菌,没有菌丝,没有常见的团壮的生长,肯定不对劲,但到底是什么,说不上来。
最后,决定换液、洗涤、离心,换瓶,操作结束后镜下看黑点几乎看不到了,有点放下心来。
隔天后去看,培养液还和上面的一样,但镜下,那种东西又出来了,在细胞少的地方,几乎呈现出粗砂粒样,我欲哭无泪,知道可能不行了,郁闷的换液后,回家上网·搜,一个名词跳了出来:黑胶虫。
黑色、杆状、运动、细胞不会很快死亡,这些描述简直惊人的一致,我确定了,我受到了黑胶虫的袭击。
但黑胶虫是什么,由于网上说法不一,我决定探究一下。
这是我的探究过程:首先,培养液略黄,稍有浑浊,镜下观察,细胞还没有死,但是已经不长了,那种东西已经是铺天盖地了,满眼望去,尽是粗砂粒样,细胞好像成了一个个汪洋中的小岛。
细胞涂片,送到化验室,革兰氏染色,不久电话回报怀疑--真菌。
第一反应不可能,亲自去了化验室,看到了片上一个个瓜子样的小点,染色呈黑色。
看我还有些怀疑,化验室的同事又作了滴片,镜下暗视野40倍可见一个个亮白色芝麻样的东西在游来游去,再次涂片染色仍和以前一样,并且可以见到芽孢样的形状,他们确定无疑是真菌,但不是常见的念珠军、霉菌,具体是什么,也说不上来。
由于已经盖棺定论,计划的HE染色、支原体没有进行。
已经将污染的细胞扔掉了。
休整几天。
细胞污染之后的拯救!对于贴壁生长的细胞,相对来说比较简单但很麻烦。
以下我主要讨论贴壁生长的细胞。
在讨论之前,大家首先要有一个概念,即洁净区,并不是没有细菌,而是细菌的数量非常少,国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米,沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点,要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里,并不是真正一个细菌都没有的,所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。
尽量减少进入培养体系细菌的数量。
所以处理细菌污染的重要原则就是:无限地稀释细菌的浓度,无限地减少细菌的数量!1).将污染的培养液倒掉,转烧瓶口,加入10mlPBS,适当晃动清洗培养瓶,然后倒掉。
转烧瓶口。
2).继续加入10mlPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶,然后倒掉。
3).继续加入5mlPBS,同样方法洗瓶,主要是培养面,然后倒掉。
4).重复步骤3再洗。
5).重复步骤3再洗。
6).加入3-5ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。
7).加入3ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。
8).再加入5mlPBS洗瓶,然后吸出。
9).加入10ml培养液,加入2ml双抗,放置培养箱培养,5小时之后,倒掉培养基,加入PBS洗瓶两次,然后加入胰酶消化,吹打后置于离心机800-1000r/min离心,然后洗一次。
置于新的培养瓶里培养,培养体系加入2ml双抗。
10).24h之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊,重复以上步骤,若看不到污染物,则继续步骤1)、3)、4)、6)、8),然后加入培养液培养,培养体系加入2ml双抗.11).24h之后,若仍污染严重,可再重复一次,若还污染只能弃之(不过一般没有出现这种情况),若镜下不见污染物,则换液PBS洗瓶,正常培养。
以上方法主要是针对贴壁生长的细胞,在操作的过程中,一定要小心操作动作,轻柔缓慢,切忌大动作鲁莽。
防止细胞脱落。
以上方法操作得当,基本上都能救活你的细胞(我还没有听到没救活的反馈)。