转基因小鼠技术
Tnni3k过表达转基因小鼠构建技术原理
Tnni3k过表达转基因小鼠构建技术原理
研究人员首先构建了由α-MHC作为启动子的Tnni3k表达质粒，并注射到胚胎中进而构建转基因动物。
值得注意的是，使用转基因方式构建的小鼠，不同的个体（或称为谱系）可能具有不同的基因型或表型。
研究人员发现TG-H谱系的小鼠在3月龄（31.3%）和12月龄（43.1%）的时候表现出异常的心重/体重比变化（heart weight/body weight, HW/BW）。
研究人员之后对这一谱系的小鼠进行了后续分析。
在3月龄时，TG-H小鼠的心脏明显大于野生型同窝小鼠（图3A）。
切片结果显示转基因小鼠具有同侧心室肥大的表型，并具有腔室尺寸较小、心室壁较厚的特点（图3B）。
镜下观察结果显示，在TG-H 小鼠中未观察到坏死或肌细胞紊乱的现象（图3C，上图）。
Masson三色染色的结果显示TG-H转基因小鼠没有间质纤维化的发生（图3C，下图）。
除此之外，研究人员通过H&E染色检测心肌细胞的横截面积，实验结果显示，TG-H谱系小鼠的心肌细胞明显更大，并且，其平均表面积比同窝对照小鼠大1.8倍（图3D）[6]。
图3. Tnni3k过表达转基因小鼠3月龄的心脏组织学分析。
(A)完整心脏的形态学照片。
(B)H&E染色后心脏的宏观视图，结果显示TG-H小鼠同侧心室肥大。
(C)心肌细胞的组织学分析，上图是H&E染色切片，下图是三色染色切片。
(D)从H&E染色的组织切片中定量心肌细胞的横截面积。
ai14转基因小鼠原理
ai14转基因小鼠原理AI14转基因小鼠是一种常用的转基因模型，被广泛应用于生物医学研究领域。
它的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中，从而使小鼠表达人类或其他物种的特定基因。
通过对AI14转基因小鼠的研究，科学家们可以深入探究与这些特定基因相关的生理和病理过程，为人类疾病的预防和治疗提供重要的基础。
AI14转基因小鼠的制备过程基本分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：科学家们首先需要确定他们想要研究的特定基因，这通常是与某种生理过程或疾病相关的基因。
选择目标基因的确定是研究的关键，它直接决定了后续实验的方向和结果。
2. 构建转基因载体：转基因载体是将目标基因导入小鼠基因组的工具。
科学家们通常使用质粒或病毒载体来构建转基因载体，其中包含了目标基因的DNA序列以及一些调控元件，如启动子、终止子和增强子等。
这些调控元件可以确保目标基因在适当的组织和时间点表达。
3. 转基因小鼠的制备：一旦构建好转基因载体，科学家们就可以将其导入小鼠的基因组中。
目前常用的方法是通过胚胎干细胞技术或直接注射载体DNA进入受精卵。
这些转基因载体会在小鼠的细胞中随着细胞分裂被复制，并最终导入小鼠的生殖细胞中。
4. 筛选和鉴定转基因小鼠：为了确定哪些小鼠成功地导入了目标基因，科学家们通常会对小鼠进行筛选和鉴定。
这包括对小鼠的DNA 进行PCR分析、Southern印迹等实验技术，以确定目标基因是否成功导入小鼠的基因组中。
5. 遗传稳定性的维持：一旦获得了目标基因转基因小鼠株系，科学家们需要确保这些转基因小鼠的遗传稳定性。
为此，他们通常会进行多代交配，并对后代进行基因型分析，以确保目标基因的稳定遗传。
通过AI14转基因小鼠模型的研究，科学家们可以深入研究特定基因在生理和病理过程中的作用。
例如，他们可以观察和分析目标基因在小鼠身上的表达模式以及对生理功能的影响，进而揭示该基因的功能机制。
此外，科学家们还可以利用AI14转基因小鼠模型来研究某些疾病的发生机制，寻找潜在的治疗靶点，并评估新药物的疗效。
转基因小鼠制备方法
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
MMTV-PyMT转基因小鼠模型介绍
MMTV-PyMT转基因小鼠模型介绍
基因敲除小鼠是什么？是否就是我们平日所说的实验室用的小白鼠?其实小鼠有很多种，小白鼠只是其中一种，通常普通的小白鼠多被药厂用作临床试验，而基因敲除的小鼠，则用于更尖端的生物医学研究。
基因敲除小鼠技术原理：是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉,然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎,生成嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后,体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。
下面是，MMTV-PyMT转基因小鼠介绍
MMTV-PyMT转基因小鼠是一种人类乳腺癌动物模型。
该小鼠使用MMTV-LTR驱动多瘤病毒中间T抗原（PyMT）在小鼠乳腺组织的表达，使小鼠出现乳腺肿瘤的表型。
可用于研究乳腺肿瘤的发生、发展及转移，及乳腺肿瘤相关药物的筛选。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。
根据目的，选择适合的转基因策略。
2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。
一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。
3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。
4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。
然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。
5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。
根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。
为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。
7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。
同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。
8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。
根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。
总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。
通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。
RNAi转基因小鼠构建技术原理
RNAi转基因小鼠构建技术原理
制作转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。
DNA 原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。
使用PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
RNAi转基因小鼠
通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。
在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。
小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
人源性抗体转基因小鼠技术(Transgenic Mouse)
人源性抗体转基因小鼠技术（Transgenic Mouse）转基因小鼠制备全人源抗体，要求人的抗体基因片段在小鼠体内必须进行较为有效的重排与表达，并且这些片段能与小鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，这些人抗基因片段能被选择，表达并活化 B 细胞分泌人抗体。
其基本方法是采用在鼠胚胎干细胞（ES）中的同源重组来使得鼠原有基因缺失，再通过显微注射等技术将重建的人源抗体胚系基因微位点转入小鼠体内，最终由 mAb 的杂交瘤分泌出全人序列的抗体。
转基因小鼠制备全人源抗体技术是现在全人源抗体制研究的主流，截至 2013 年，已有 5 个由转基因小鼠制备而来的全人源抗体被批准上市，20余个正处在临床试验中。
目前主要的转基因小鼠制备全人源抗体技术有HuMAb-Mouse、Xeno Mouse、VelocImmuneTM 三种方法HuMAb-Mouse： HUMab 转基因小鼠整合入人抗体基因 450kb(200kb Ig H；230kb Igk，约占人类Ig Gκ的 50％)，免疫该小鼠可以产生 0.1-5nmol／L 的抗体。
虽然该小鼠转入的人抗体基因组还是比较小，但仍获得巨大成功Xeno Mouse： Xeno Mouse 转基因小鼠也是目前最为成功、应用最广的转基因小鼠之一。
该转基因小鼠整合入大部分人抗体 VH 和Vκ基因，大小分别为1020kb 和 800kb。
重链包含 34 个 V 区基因、所有的重链 D 区和 J 区，以及Cγ2、Cμ和Cδ基因，共 66 个功能基因；轻链包含 18 个 V 区基因、所有的 5 个 J 区和Cκ基因，共 32 个功能基因。
该转基因小鼠 XMG2-KL 可以产生全人 IgM 和IgG2，亲和力达到0.1～1nmol／L。
VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台，VelocImmuneTM 产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文1 转基因小鼠技术概述自其诞生以来的30多年里，转基因动物技术经过世界各国生物学家们的不懈努力，已经成为一项非常成熟的技术手段，极大的促进了相关生命科学领域研究进展，至今已经取得了辉煌的成就并且在不断得到改进和发展[2]。
转基因技术运用于动物育种的研究始于70年代，经过近30多年的研究和不断发展，取得了突破性进展。
1974年Jaenish和MintzIZI[3]通过微注射法向移植前的小鼠注射SV40病毒DNA，后在实验小鼠部份细胞中检测到该病毒的DNA，首次成功获得转基因小鼠，虽然该转基因小鼠传代的几率小。
随着科学技术的不断进步，在1976年，Jaenish又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎，将目标基因组整合到实验鼠中得到了能传代的转基因小鼠；1980年,Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠。
1982年美国科学家Palmiter将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵后，获得了首批被称为“硕鼠”的转基因动物[4]。
1985年，Hanahan等将SV40T抗原基因与大鼠胰岛素启动子(RIP)体外整合后导入小鼠早期胚胎细中，构建了SV40T抗原基因转基因小鼠，在小鼠体内检测到特异性T抗原，T抗原表达时间的早晚影响转基因小鼠对T抗原的免疫应答：胚胎早期表达T抗原的小鼠对SV40T抗原发生免疫耐受，胰腺组织正常；胚胎晚期表达T抗原的小鼠体内产生抗自身胰岛B细胞的抗体，出现自身免疫性糖尿病[5]。
近年来，随着现代分子生物学和转基因动物技术的日臻完善，转基因小鼠及其他转基因动物逐渐成为现代医学及其他学科研究中的一个十分重要的工具。
纵观此间发展历程，转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式，极大地降低生物药品的成本和投资风险，为人类社会带来了新的经济增长点，如今的动物乳腺反应器生产的药物占所有基因工程药物的95％，带来了巨大经济效益，潜藏巨大的市场价值，相信随着应用的不断革新，其必将逐渐形成具有高额利润的新兴产业。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
转基因小鼠原理
转基因小鼠原理
转基因小鼠是通过将外源基因导入小鼠的基因组中，使其具备某种特定的基因表达或功能。
下面将介绍转基因小鼠的原理。
转基因小鼠的制备主要包括以下步骤：
1. 外源基因的选择：根据研究的需要，选择具有特定表达或功能的外源基因。
这些基因可以来自于同一物种的其他个体，也可以来自于不同物种。
外源基因通常与标记基因（如荧光蛋白）连在一起，以便在小鼠体内进行检测或追踪。
2. 载体构建：将外源基因插入到合适的载体中。
这个载体通常是一个环状DNA，能够在细菌中进行复制。
载体还包括选择
性标记基因，用于筛选带有外源基因的细菌。
3. 载体的导入：将构建好的载体导入到干细胞中。
这一步通常通过细菌转化或化学方法实现。
被导入的载体被融合到小鼠的染色体中，成为其基因组的一部分。
4. 选代与筛选：经过导入外源基因的干细胞进一步进行培养和筛选，确保外源基因被稳定地遗传给后代。
5. 建立转基因小鼠系：通过转基因小鼠的选择性繁殖，建立稳定的转基因小鼠系。
这些小鼠在其体细胞中都带有外源基因。
通过以上步骤，转基因小鼠就能够被制备出来。
这些小鼠可以被用于研究基因与某种生理或疾病相关的功能和表达。
转基因
小鼠的制备对于科学研究、药物开发和疾病治疗等领域具有重要意义。
转基因小鼠的制备流程图
转基因小鼠的制备流程图
1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。
后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。
这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们一般意义上所说的转基因小鼠。
转基因小鼠的制备方法
“转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。
DNA原核显微注射法通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵,使外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。
转基因小鼠的制备流程图。
转基因大（小）鼠常用品系及类型
转基因大（小）鼠常用品系及类型制作转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。
DNA 原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。
赛业所使用的PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！PiggyBAC法转基因利用PB转座子特有的“剪切粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由转移”，从而介导外源DNA片段与基因组整合。
常用大小鼠品系C57BL/6小鼠：目前公布的小鼠基因组测序结果来源于C57BL/6小鼠品系。
该品系小鼠模型已广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究，并已成为发表文章的首选小鼠品系。
FVB小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比较单一；具有易于原核注射的优点。
SD大鼠：适合用于研究心血管、神经系统等器官发育的常用模式动物品系。
转基因大（小）鼠类型1、过表达转基因大（小）鼠构建上述常规的带有启动子和目的基因的表达载体，利用原核显微注射的方法将表达载体注射到小鼠受精卵中。
通过构建广泛性/组织特异性/诱导性等不同的启动子，实现转基因在小鼠组织广泛性/特异性/特定条件下等的表达，达到对目的基因功能的研究目的。
2、RNAi转基因大（小）鼠通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。
在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。
3、microRNA转基因大（小）鼠构建上述两种microRNA过表达和下调载体，通过原核显微注射将载体注射到受精卵中，通过基因表达，实现microRNA过表达或者下调。
4、可诱导性/组织特异性转基因大（小）鼠将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因大（小）鼠模型，转基因在正常情况下并不表达，只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop 终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达的目的。
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文1 转基因小鼠技术概述自其诞生以来的30多年里，转基因动物技术经过世界各国生物学家们的不懈努力，已经成为一项非常成熟的技术手段，极大的促进了相关生命科学领域研究进展，至今已经取得了辉煌的成就并且在不断得到改进和发展[2]。
转基因技术运用于动物育种的研究始于70年代，经过近30多年的研究和不断发展，取得了突破性进展。
1974年Jaenish和MintzIZI[3]通过微注射法向移植前的小鼠注射SV40病毒DNA，后在实验小鼠部份细胞中检测到该病毒的DNA，首次成功获得转基因小鼠，虽然该转基因小鼠传代的几率小。
随着科学技术的不断进步，在1976年，Jaenish又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎，将目标基因组整合到实验鼠中得到了能传代的转基因小鼠；1980年,Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠。
1982年美国科学家Palmiter将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵后，获得了首批被称为“硕鼠”的转基因动物[4]。
1985年，Hanahan等将SV40T抗原基因与大鼠胰岛素启动子(RIP)体外整合后导入小鼠早期胚胎细中，构建了SV40T抗原基因转基因小鼠，在小鼠体检测到特异性T抗原，T抗原表达时间的早晚影响转基因小鼠对T抗原的免疫应答：胚胎早期表达T抗原的小鼠对SV40T抗原发生免疫耐受，胰腺组织正常；胚胎晚期表达T抗原的小鼠体产生抗自身胰岛B细胞的抗体，出现自身免疫性糖尿病[5]。
近年来，随着现代分子生物学和转基因动物技术的日臻完善，转基因小鼠及其他转基因动物逐渐成为现代医学及其他学科研究中的一个十分重要的工具。
纵观此间发展历程，转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式，极大地降低生物药品的成本和投资风险，为人类社会带来了新的经济增长点，如今的动物乳腺反应器生产的药物占所有基因工程药物的95％，带来了巨大经济效益，潜藏巨大的市场价值，相信随着应用的不断革新，其必将逐渐形成具有高额利润的新兴产业。
小鼠基因工程技术和模型动物的应用
小鼠基因工程技术和模型动物的应用随着科技的不断发展，基因工程技术在生物学、医学等领域的应用日益广泛。
而作为实验室中最常用的动物模型，小鼠因其具有较高的相似性和可操作性成为了基因工程技术的研究对象，也是许多疾病研究的重要工具。
本文将从小鼠基因工程技术以及小鼠在疾病研究中的应用两个方面来探讨这一话题。
小鼠基因工程技术主要分为三种：基因缺失、基因突变和转基因。
在基因缺失技术中，研究人员通过基因敲除或基因敲入等手段实现了对某些基因的“失活”或“激活”。
例如，研究人员使用基因敲除手段成功地制造了缺失Sod1基因的小鼠模型，这种模型可用于研究与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的神经元损伤机制。
而在基因突变技术中，则是通过化学或辐射等方式对小鼠胚胎进行干扰，使得其基因序列发生突变，从而制造了一些与人类疾病相关的基因突变小鼠模型。
例如，基因突变技术使研究人员制造出一些患有神经退行性疾病的小鼠模型，这些模型可用于深入研究该类疾病的发生机制。
最后，转基因技术则是将外源基因注入小鼠胚胎细胞，使其带有该外源基因的小鼠后代能够被用于研究某些疾病的发生机制。
例如，研究人员使用转基因技术，制造了患有人类疾病相关（如肥胖症、糖尿病，乳腺癌等）基因的小鼠模型，这些模型可用于研究人类这些疾病的发生机制。
除此之外，在小鼠的疾病研究中，小鼠模型也是非常重要的一种研究工具。
因为小鼠的基因组与人类基因组有很高的相似性，且小鼠具有稍高的繁殖速度和繁殖量，因此可作为人类疾病模型的代替品。
例如，通过制造患有人类先天性免疫缺陷病的小鼠模型，研究人员可以发现这些疾病的发生机制，并寻找到相应的治疗方法。
又如，研究人员使用缺乏某些基因的小鼠模型，来研究心力衰竭、肺癌、皮肤癌等疾病的发生机制和治疗方法。
基因工程技术的应用和小鼠模型带来了众多的优点，但也有其不足之处。
最为直接的不足之处是人工干预造成的不可避免的影响，如小鼠模型与人类的差异性。
其次，还有复杂的基因调控和互作网络，往往要同时研究多个基因和蛋白质相互作用才能全面了解疾病机制。
hCD3ε转基因小鼠技术原理
hCD3ε转基因小鼠技术原理将人源CD3ε 的编码序列构建到小鼠CD3ε 启动子和增强子驱动的表达载体[3]，以确保人源CD3ε 在小鼠体内的表达谱正确。
通过显微注射建立人源化CD3ε 的转基因小鼠。
人CD3ε 转基因载体示意图FACS 分析小鼠外周血表明，人源CD3ε 分子特异的表达在CD3 阳性的小鼠 T 细胞。
与野生小鼠相比，转基因小鼠的 T 细胞和 NK 细胞比例没有发生明显变化。
T 细胞激活实验表明，人和鼠的CD3ε 抗体都能激活转基因小鼠的 T 细胞。
说明人源CD3ε 在小鼠 T 细胞上表达和参与构成 CD3 分子复合物，而且可以被hCD3ε 特异性抗体结合并激活 CD3 分子介导的 T 细胞活化信号，从而具有测试双特异抗体药物的功能。
（1）流式分析hCD3ε/Vst 小鼠外周血中hCD3ε 的表达。
C57BL/6N 小鼠hCD3ε/Vst 小鼠（2）流式分析hCD3ε/Vst 小鼠外周血中 B、CD4+T、CD8+T和 NK 细胞的含量。
结果可见hCD3ε 转基因，不影响hCD3ε/Vst 小鼠 B、T 和 NK 细胞的分化。
（3）分别使用小鼠和人CD3ε 抗体处理hCD3ε/Vst 小鼠（野生型 C57BL/6 为对照）后，免疫细胞反应的流式分析。
结果可见，人CD3ε 抗体处理，在hCDε/Vst 小鼠中可以有效地活化 T 细胞，而野生型 C57BL/6 小鼠只有抗小鼠的CD3ε 抗体才能有效激活 T 细胞。
确认人源CD3ε 的表达特异性和功能正常之后，我们使用人源CD3ε 转基因小鼠进行了双特异性抗体药效实验。
肿瘤生长曲线小鼠平均体重曲线结果表明：测试的双特异性抗体 CS4、Y6 和 Y7 能够完全清除接种于hCD3ε 小鼠上的肿瘤细胞，而生理盐水和另两种供试品 M-I,M-K 未能抑制肿瘤的生长，证明此模型可以有效的评估双特异性抗体的抗肿瘤药效。
hCD3ε 小鼠背景为 C57BL/6N，为了能够同时接受 BALB/c 等其它遗传背景来源的小鼠肿瘤细胞，我们可采取与BALB/c 等小鼠杂交一代的方式建立荷瘤模型。
转基因小鼠研究进展
转基因小鼠的研究进展1 转基因小鼠技术发展以往的转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。
但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。
因为在一个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、相互影响的。
而且，一个基因在单一细胞中的表达究竟会对整个机体的生理功能产生什么作用也必须在整体水平来研究。
从60年代开始，生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法，将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内，以便研究基因的功能及调控规律。
到70年代中期，几种将外源基因导入早期哺乳动物胚胎的方法逐步建立起来，从而为建立转基因小鼠奠定了基础。
1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。
“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。
转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。
其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段。
1.1第一阶段：实现外源基因的导入1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。
这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。
以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移，并能遗传给后代。
在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。
这一阶段转基因技术的共同特点是导入的外源基因是随机整合的。
这种随机整合的外源基因可能是单拷贝的，也可能是多拷贝的。
外源基因整合的结果可能会有几种情况出现：①能够有效地表达，且不影响动物的发育以及正常的生理功能。
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4、体细胞核移植法
显微法和克隆法效率比较
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1997 Nature 385, 810–
4、体细胞核移植法
优点 减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那 些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。 事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛 选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力, 具有很大的优越性。 缺点
转基因小鼠技术
---转基因小鼠的构建
李懿萍
2010.05.20
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基因打靶的简易程序
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胚胎干细胞（ES细胞）法
优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、 表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛 选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
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小鼠的历史
15. 1983年 -- PCR
Kary Mullis --1993年的诺贝尔奖
16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠
Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几 个研究小组--- 2001获得了Lasker奖
缺 点
精密仪器， 供体细胞易 技术操作较难，衰老 易造成宿主动 物基因组的插 入突变
有些结果 不能重复
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Electroporation
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转基因小鼠技术
---转基因小鼠在科研中的应用
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小鼠的历史
1. 7500万－1.25亿年前 -- 人鼠始祖
2. 19世纪 -- 宠物鼠---实验鼠的“先驱”
3. 1897年 -- 重组表型
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3、逆转录病毒感染法
优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的 高度整合特性, 大大提高基因转移的效率 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中 扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 获得纯合体的转基因动物的机会少 病毒载体构建复杂 转入的外源基因的大小受到限制, <10kb 转入病毒自身基因的复制表达
细菌-动物细胞-转基因动物
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转基因动物生物反应器研制
乳腺生物反应器具有以下特点： ⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响； ⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器； 一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊 一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 换成医用蛋白，产量十分可观。 ⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品； ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。
基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；
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基因工程定向育种
向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达， 能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种 之间遗传物质的交换。 实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其 精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异， 从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。 转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等
鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或 减弱基因整合的位置效率。
缺点：
不稳定，制备工艺繁琐。
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7、BAC法（人工细菌染色体法）
建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可>300kb。
F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。 100kb,近百个蛋白质。
体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基 础理论和实验技术上还需进一步探索。
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5、精子载体法
将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能 力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植, 这样产生的动物也会使外源基因得到表达。 精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法
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4、体细胞核移植法
首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选 出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核 供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞 中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中 1997 年, 英国Roslin 研究所的Wilmut等利用成年绵 羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获得了体细胞克隆绵羊 多莉(Dolly) ,拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。
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转基因动物生物反应器研制
转基因动物生物反应器概念：
将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入 动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外 源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些 组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基 因产物。 乳腺---理想器官
肾脏和膀胱
多肽药物、蛋白质疫苗、酶类
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小鼠的历史
10. 1953年 -- DNA双螺旋
Crick，Watson和Wilkins三人因为这项 杰出的成就荣获了1962年的诺贝尔奖。
11. 1966年 -- 遗传密码破译
Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破 译了遗传密码---分析（借助标记loxp和cre
重组酶；
BAC载体两端有Sp6和T7
引物序列利于测序，确定基因的
染色#43;BAC大肠杆菌
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基因转移方法的比较
方 法 优 点 显微注射 外源基因整合 效率较高，不 需要载体，目 的基因的长度 可达100Kb 核移植 转基因效率 高；预测基 因表达水平； 可以使用定 点整合技术 胚胎干细胞 外源DNA的 整合率高； 整合在生殖 细胞中的比 例也很高。 ES细胞株不 易建立，长 期培养后出 现分化现象； 生产的转基 因动物都是 嵌合体 逆转录病毒 可在整合点 整合转移基 因的单个拷 贝； 插入的基因 有大小限度； 嵌合性很高； 外源DNA 在 动物各种组 织中的分布 不均 应用 具有 一定 局限 性 基因 敲除 精子介导 该方法简 单、方便
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小鼠的历史
4. 1900年 -- 从宠物鼠到实验鼠
Abbie Lathrop----饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传 学研究。哈佛大学---老鼠的毛色进行观察，以检测 孟德尔法则的正确性。
5. 1905年 -- 孟德尔老鼠
通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家 Lucien Claude Cué 发现，两个携带黄色皮毛基因 no 的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老 鼠的数量比总是2:1。--这是报道的第一个等位纯合 致死的基因。
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3、逆转录病毒感染法
主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域 具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR 下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒, 去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基 因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。
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小鼠的历史
8. 1921年 -- C57BL株系
基因组测序在2002年完成
9. 1929年 -- Jackson 实验室 ---世界上最重要的小鼠遗传学研究中心
在Hudson 汽车公司的头目Edsel Ford 和Roscoe Jackson两位大财主的资助下， Charence Little 在美国缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室
23. 2002年8月 -- 小鼠基因组物理图谱
24. 2002年12月 -- 小鼠基因组
小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图， 并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为 2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有 40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小 鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组 成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN 基因组科学实验室 的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。
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小鼠的历史
6. 1909年 -- 实验鼠的诞生
Clarence Cook Little是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育 出了第一个近亲繁殖的小鼠株系――DBA。
7. 1916年 -- 肿瘤易受性和组织相容性
Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不 会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。 Jackson实验室的George Snell在1940年代发现了组织相容性基因---荣 获了1980年的诺贝尔奖