9 第九讲2 超低温保存技术
超低温保存技术的相关机理综述
二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。
具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
同时，氯化铬，氯化锰等过渡金属卤化物与氯化钾，氯化钠等卤化物在DMSO中有一定溶解度，故可以应用在有机电化学中。
二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。
除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。
二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。
DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。
用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。
是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。
对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。
也可作为农药的添加剂。
也是一种十分重要的化学试剂。
DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。
DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤.在防冻剂中的应用纯DMSO 的冰点是18.45℃，含水40%的DMSO在-60℃不冻，而且DMSO与水、雪混合时放热。
这种性质使DMSO可作为汽车防冻液、刹车油、液压液组分。
乙二醇防冻液在超过-40℃低温时已不适用。
而且比DMSO沸点低，有毒，易生产气阻。
DMSO 防冻液在北部严寒地区用于除冰剂，涂料、各种乳胶的防冻剂，汽油、航煤的防冰剂，骨髓、血液、低温保存的防冻剂等。
超低温保存的原理
超低温保存的原理
超低温保存时，降温冷冻和化冻过程最易引起植物材料的伤害。
在降温冷冻过程中，植物组织或细胞遭受冻害主要有两个方面的原因，即细胞内部结冰和细胞内溶质的浓缩。
由于细胞质最初是高渗透压的，故而一般先使细胞外结冰，使得细胞膜内外的渗透压梯度发生反转，即发生细胞失水并逐渐变为脱水状态，导致细胞的溶质也相应地发生浓缩。
当细胞收缩超过临界值时，会造成细胞的损伤。
一般说来，慢速降温可使细胞内的水不断流到细胞外结冰，而快速降温时，细胞内的水来不及流到细胞外而造成胞内结冰。
因此，在降温冷冻过程中必须创造一个适宜的条件，使植物材料发生保护性脱水。
冬季的植物材料，由于经过抗寒锻炼已经发生了保护性脱水及其他提高抗寒力的变化，所以采用冬季植物材料超低温保存容易获得成功。
采用一些“冷冻保护剂”或称“防冻剂”可明显地增强生物组织的抗冷和耐冷能力，目前实践中往往采用如二四基亚砜、聚乙二醇（PEG）、甘油及多种糖类等多种防冻剂配合使用以提高效果。
在化冻时要防止细胞内次生结冰，因此，多数情况下采用快速化冻方法，即在3440摄氏度温水中化冻。
非渗透型冰冻保护剂
四、解冻与再培养
➢ 超低温保存效果与化冻速度有密切关系， 不同的材料应采用不同的化冻方式
• 液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组 织），可采用快速化冻的方法
• 液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢 速化冻法
• 生长季节中的材料，一般在37～40℃温水浴 中快速化冻比在室温下快速化冻要好
• 木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在 0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果
三、冰冻保护剂的应用
冰冻保护剂（Cryoprotective agent, CPA）也 称抗冻剂，对生物体低温保存必不可少
冰冻保护剂应具有易溶于水，对细胞无毒， 容易从组织细胞中清除等特点
冰冻保护剂的作用是增加膜透性，加速细 胞内自由水向外流动实现适度脱水；降低 冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长， 降低低温伤害
• 玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速 化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成 的伤害
再培养
经冻存的材料会不可避免地受到不同程度 的伤害
冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养一到 两周，再转入正常光下培养
再培养所用的培养基一般是与保存前的相 同，但有时须将大量元素和琼脂含量减半， 有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解 酪蛋白等成分以利于生长的恢复
• 不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力、对水分子 活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷却， 而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性
➢ 非渗透型冰冻保护剂
• 多为一些聚合分子物质，能溶于水，但它不能进 入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下 降低溶质（电介质）浓度，从而起到保护作用
• 主要有聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingyl pyrollidone， PVP）、蔗糖（Sucrose）、葡萄糖（右旋糖酐， Dextrane）、聚乙二醇（PEG）、白蛋白 （Albumin）、羟乙基淀粉（Hydroxyethyl starch， HES）等
植物细胞组织和器官超低温保存
低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
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2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
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当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
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一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
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(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
超低温保存名词解释
超低温保存名词解释超低温保存的条件是在摄氏- 40至-70度。
人们利用液氮或液氧来制冷，再把物品放入其中进行保存。
利用液氮的零下196度的低温以液氮或液氧作为超低温冷冻剂来储藏食物，它无臭、无毒、不易燃，因此可以安全地保存食物新鲜品质而不损失营养成分。
这种技术叫做“超低温保存”。
1、对象物体在较低温度下保存，又称低温保存;被保存的物体，需要在一定温度下才能保持原来的物理化学性状和生物特性。
2、常见于低温恒温槽(室)、冰箱和真空冷冻干燥机内使用。
为使物质在较低温度下也能具有某些共同的性质，需要让物质在低温状态下也能保持这些性质，以便于长期保存，就需要降低物质本身的热力学性质，所谓降低，即指物质温度下降。
3、物质从常温到达某一特定温度时，其物理、化学及生物等性质随着温度的升高而显著变化，甚至发生转变，这个过程叫做“物质的热力学性质”，这个由高温向低温的相变过程叫做“热力学转变”，这个状态变化叫做“物质的相变”。
4、简单的物质发生相变所需要的临界点，称为“相变点”，它也是一个温度，常用T表示，它随着温度的增加而下降。
5、当大量相变过程集中在一个温度上时，此温度称为“相变点”。
6、实验证明：任何化合物都可以发生相变，且相变速率与该化合物的熔点无关，仅与该化合物的体积膨胀系数有关，在体积不变时，相变前后的体积差值越大，则相变速率越快。
7、相变的特征之一是相变潜热在不同温度下呈现出极大值，即为了获得更多的有用信息，在实验时，应选择一个体积膨胀系数较小的化合物作为相变的对象。
2、物体在较低温度下保存，会产生不同的效果。
把食物或药材在极低的温度下贮藏，可以减少食物的氧化，还可以防止微生物的繁殖，延长保存时间。
但低温保存不宜在密闭环境下进行。
3、常用的方法是用液氮将食物冷冻，然后再保存，可以长期保存。
为此，在国际上专门为保存食物制订了超低温保存规范，要求将食物保存在摄氏零下20至零下30度之间，并对温度敏感的食物，如香肠、咸肉、鱼干等要严格控制。
超低温技术在冷冻保存中的应用
超低温技术在冷冻保存中的应用随着人类社会的不断发展，食品、生物医学、电子等领域对低温技术的需求也越来越高。
而超低温技术在各个领域的应用也越来越广泛。
特别是在冷冻保存领域，超低温技术不仅可以有效地延长食品、生物医学制品以及电子元器件的保存期限，还可以更好地保护它们的质量和性能。
一、超低温技术的概念和分类超低温技术是指将物质的温度降低到极低的程度，以达到所需的处理效果的技术。
它可以将物质的温度从普通的低温状态降低到接近绝对零度（-273.15℃）的极低温状态。
根据温度的不同，超低温技术可以分为常规低温、超低温、极低温等多个等级。
常规低温指的是0℃以下但未达到-40℃的温度范围。
常规低温技术在食品、医药等领域的冷链运输和储存中得到广泛的应用。
超低温指的是-40℃～-80℃之间的温度范围。
在这一范围内，物质的温度降低到可以抑制其变质和失活的程度。
极低温指物质的温度降低到已经接近绝对零度（-273.15℃）的状态，其中液氮温度甚至可以低于-196℃。
在这个温度范围内，物质几乎可以永久保持其原有的生理、化学和物理性质。
二、超低温技术在食品冷冻中的应用食品是我们生活中必不可少的物质之一，保鲜和储存食品是人们日常生活中必须要解决的实际问题之一，而超低温技术在这个领域的应用也十分广泛。
它可以将食品中的水分以及细胞内的水分逐渐减少到无法支持细菌或微生物生存的程度，从而从根本上抑制了食品的腐败。
超低温技术在冷冻保存食品中的应用十分广泛。
在超低温冷冻的过程中，食品中的细胞水分和细胞外的水分都会被冻结。
当冷冻过程中水分形成晶体时，会对细胞结构和化学组分进行一定的破坏。
为此，超低温技术的关键在于冷冻速度。
在快速冷冻的情况下，水分在形成冰晶的过程中无法形成大型结晶，使细胞更容易恢复到其原有状态。
三、超低温技术在生物医学中的应用生物医学材料是人类医疗保健过程中必不可少的物质。
生物医学中的信号传输和诊断都与微电子技术有着密切的关系，而微型元件的工作和参数取决于其制造和使用的环境温度。
【正式版】超低温冷冻保存种质PPT资料
FDA、TTC等染色的方法进行快速检测，只能作为生活力的预测指标
FDA、TTC等染色的方法进行快速检测，只能作为生活力的预测指标
将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
常用的是DMSO。 按保存类型分类可分为两种类型
原生境保存
1973年科学家首次成功地超低温保存了 胡萝卜悬浮细胞。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
分子质量较小 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃温水浴中进行解冻的方法。
按保存类型分类可分为两种◆类型
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害的影响，不受季节限制。
易于与溶剂混合 将降处温于 至0-1℃96或℃其的他方预法处。理温◆度的材料以1—2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连续 快速渗入细胞 使用生长延缓剂：多效唑、矮壮素
常用的是DMSO。
按保存类型分类可分为两种类型 降低环境中的氧含量：低气压处理、低氧分压处理
抑制外植体生长的离体保存方法
种质资源超低温保存是将植物的细胞或组织经过防冻处理后, 在液氮超低温- 196℃下保存的方法。
生物细胞的低温冻存是防止生物种质灭绝的重要途径
1973年科学家首次成功地超低温保存了 胡萝卜悬浮细胞。
更为有效。
降温冰冻操作
快速冷冻法 慢速冷冻法 预冷冻法 干燥冷冻法 包埋脱水法 玻璃化法
1、快速冷冻法
指将植物材料从0℃或者其他预处理温度直接 投入液氮中保存的方法，降温速度1000℃/min。
2、慢速冷冻法
将处于0℃或其他预处理温度的材料以1— 2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃， 稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连 续降温至-196℃的方法。
种子学吕世琦种子的超低温贮藏
种子超低温贮藏的优点
1. 超低温贮藏保存植物种子，选择适当的 冷冻容器后， 除了 30～60天补充一次液氮外， 不需要机械空调设备 及其它管理，节省了大量 的人力和物力 ，是一种省时、省工 、省费用的 种质保存新技术 2.可保持被保存种子的遗传稳定性 ，适合 于长期保存珍贵稀有种质
种子超低温贮藏的技术关键
不同的包装材料对种子的发芽率和生长势有不同的影响，有试验表 明，液氮保存种子使用聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。
包装材料 聚乙烯塑料袋 牛皮纸 铝箔
发芽率% 94.00a 78.00b 95.33a
生长势 76.69a 78.56a 77.53a
不同包装材料对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响
种子超低温贮藏的技术关键
3.适宜的种子含水量
植物种子液氮保存时都有一个适宜的含水量范围液 氮保存并非含水量越低越好 ，含水量降到一定极限则产 生脱水损伤 ，导致种子发芽能力伤失。有实验表明低含 水量 (7％ 一9％)的种子保存 在液氮 中的 发芽率低于自然 风干种子(12％ ～14％)的发芽率 。
2. 可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种
质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交
换。
参考文献 1、张玉凤，董经纬，，蒋菊生，黄绵佳. 种子贮藏 的研究进展. 安徽农业科学，2007,35（19）： 5855-5856. 2、赵跃平，燕平梅，邢勇，张小冰，王小丽. 作物 种子超低温保存方法的构建. 种子科技， 2012,09:27-30 3、文彬，种子贮藏生理学发展史概略.自然辨证法 通讯，2008,30（177）：69-74 4、T. L. Malkin, A. Goddard, D. E. Heardetal.. Measurements of OH and HO2 yields from the gas phase ozonolysis of isoprene[J]. Atmospheric Chemistry and Physics, 2010, 10(3).
9 第九讲2 超低温保存技术
1.4 逐步冰冻法 此法是制备不同等级温度的冰浴如-20℃、50℃、-70℃、-100℃或-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等使植物材料经保护剂在0℃预处 理后，逐渐适应这些温度，材料在每级温度上停 留一定时间(4～6min)，使细胞达到保护性脱水， 然后投入液氮中. 殷晓辉通过对几种野生稻愈伤组织冰冻保存 研究，得出的降温程序是：（1）0→-10℃速度 是1℃.min-1停留15min；（2）-10→-40℃速度 是1℃.min-1 ，停留60min；（3）-40→-196℃。
对于单细胞来说常规超低温保存中的胞外冰晶几乎是不具有伤害性的但对于整个器官或组织来说所谓的胞外冰晶仍然是在细胞的间隙中仍会对细胞产生伤现在玻璃化法冻存采取完全玻璃化法即胞内胞外同时为玻璃化状态在器官和组织水平保存
超低温保存技术
超低温保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196℃）中使保存的生物 材料的物质代谢和生长活动几乎完全停止，而细胞活力 和形态发生的潜能仍保存。 这样有利于保存和抢救物种，尽可能避免组织细胞 培养及自然界中积累性突变等的发生，便于国际间的种 质交换。经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高 抗寒性的新材料。 超低温保存正成为长期稳定地保存植物种质资源及 珍贵实验材料的一个重要方法。
2.2 包埋玻璃化法(encapsulationvitrification) 其基本操作程序：预培养和包埋→玻璃化溶 液脱水→液氮保存→化冻→恢复培养。 这种方法实质上是将包埋脱水法的包埋和玻 璃化法结合在一起，它减少了脱水的时间，简化 了冻存程序，且比包埋脱水法有更高的成芽率。 但是对某些植物而言，包埋玻璃化法不一定 是最适合的，这可能与基因型有关。辣根包埋玻 璃化法冻存3天后，成活率为60%，用包埋脱水法 保存成活率大于90%。
超低温保存名词解释
超低温保存名词解释超低温保存(ultra-low-temperature preservation)超低温保存(ultra-low-temperature preservation)是指利用液氮或液体二氧化碳等温度极低的气体为超低温保存剂，对生物样品进行冷冻保存。
超低温保存是在现代医学中应用最广泛的保存技术之一。
液氮的临界温度为-196 ℃，能够保持样品长期不变质;二氧化碳临界温度为-90 ℃，经常被加入到液氮中作为冻存保护剂，一般加入的量为1%～2%，这种混合物既不会使样品受损，又能保证较高的储藏效果。
超低温保存有效地解决了传统冰箱保存方法(例如，水果、蔬菜、细胞等)在低温条件下保存易出现的变质问题，因而已成为近年来生命科学研究的热点之一。
近年来，随着各种DNA、 RNA、蛋白质、核酸、多糖及其他生物大分子的结构和功能研究的发展，越来越多的样品需要进行超低温保存。
在超低温条件下，细胞内原生质体系的结构和功能特征发生了巨大变化，蛋白质、核酸、多糖及其他大分子复合物可以达到玻璃化转变温度(Tg)以下而不失活。
对于DNA、 RNA、蛋白质和核酸等大分子生物大分子，由于不同于常规低温下的溶解状态，在超低温下能够维持很长时间而不失去活性，甚至变得更加稳定，能更好地保持生物大分子的空间结构和活性，所以在理论上和实践上都具有重要意义。
温度下降时，大分子从溶液中析出，沉积于试管底部形成颗粒状的结晶，并逐渐增多。
随着温度继续下降，颗粒迅速增大，就像煮鸡蛋一样，最后形成类似羊毛状的结晶，此即玻璃化转变温度(Tg)大分子结晶。
因为超低温保存要求的温度比细胞内低得多，故一旦大分子结晶析出，就失去了冻存目的。
一些科学家把这种条件称为凝胶点(glass-point)。
如果温度降到Tg，大分子完全停止增长，即达到完全的玻璃化转变。
所以，超低温保存必须达到这一条件，才能起到保护作用。
超低温保存剂在较低温度下可以长期保存生物样品。
植物材料超低温保存方法
植物材料超低温保存方法摘要：一、引言二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性2.细胞内生物大分子的稳定性3.细胞器的稳定性三、超低温保存方法的步骤1.样本处理2.低温预处理3.快速冷冻4.低温储存四、超低温保存方法的优点1.保存时间长2.保存条件简单3.保存材料活性高五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织2.动物组织3.微生物六、注意事项1.低温设备的选用2.冷冻速度的控制3.储存条件的维持七、结论正文：一、引言随着科学技术的不断发展，植物材料超低温保存方法在生物学、农业科学等领域具有重要意义。
这种方法可以长时间保存植物材料，保留其生物活性，为科学研究和农业生产提供了有力保障。
二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性：超低温保存方法可以保持细胞膜的完整性，避免细胞内容物泄漏。
2.细胞内生物大分子的稳定性：低温条件下，生物大分子如DNA、蛋白质等结构稳定，功能完好。
3.细胞器的稳定性：超低温保存方法有利于细胞器的结构和功能保持不变。
三、超低温保存方法的步骤1.样本处理：首先对植物材料进行切片、涂片或粉末处理，以便于后续操作。
2.低温预处理：将处理好的样本放置在4℃条件下，进行低温适应。
3.快速冷冻：将预处理好的样本迅速置于液氮中，快速降低温度。
4.低温储存：将冷冻后的样本放入-196℃的液氮中，长期储存。
四、超低温保存方法的优点1.保存时间长：超低温保存方法可以延长植物材料的保存时间，有利于长期研究。
2.保存条件简单：只需低温设备和液氮，无需复杂设备和技术。
3.保存材料活性高：低温条件下，细胞器和生物大分子保持活性，有利于后续实验研究。
五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织：适用于各种植物组织的超低温保存，如叶片、茎尖等。
2.动物组织：适用于动物组织样本的超低温保存，如胚胎、肌肉等。
3.微生物：可用于微生物菌株的超低温保存。
六、注意事项1.低温设备的选用：选择合适的低温设备，确保样本在低温条件下得到有效保存。
第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立
第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立第一节植物细胞培养物超低温保存的概念与作用植物细胞全能性的发现和证实为植物的种质保存开辟了新的途径。
随着植物细胞工程技术的长足发展，植物细胞培养物超低温保存及种质库的建立日益引起人们的重视，并已取得明显进展。
一、植物细胞培养物超低温保存的概念种质资源低温保存的英文名称是cryopreservation，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。
一般而言，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度即－70℃称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，1998）。
对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。
目前，冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是常用的植物细胞培养物超低温保存方法。
二、植物细胞培养物超低温保存的作用1. 保持细胞培养物的遗传稳定性在细胞培养物的不断继代培养过程中，染色体和基因会发生改变，从而引起基因型的改变，如产生多倍体、非整倍体及染色体消失和染色体易位等。
这些变化导致培养细胞全能性的丧失，即失去形态发生的潜能，或一些具有特殊产物的细胞系和具有某种抗逆性的细胞系有可能在继代培养中丢失重要的性状。
已有的研究表明，细胞培养物在液氮超低温保存中不仅能长期保持形态发生的潜能，而且还能保持遗传性状的稳定性，为细胞克隆遗传稳定性的保持提供了一种理想的方法。
2. 植物种质资源的长期保存农业的未来取决于人类对植物种质资源的占有和利用程度，但由于农业土地的急剧开发，天然植物种质资源日益遭到严重破坏，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源。
因此，建立长期保存植物种质资源库势在必行。
由于细胞培养物能在超低温保存后再生完整的新植株，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。
体细胞种质库的建立是植物种质资源保存的一个重要方面，因为体细胞能够在人工试管条件下大量迅速繁殖，可以节省种子保存过程中资金的耗费。
3. 农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存种子低温保存是防止良种衰变的一条重要途径，但需要大规模基本建设，且耗资较多。
低温保鲜技术及原理
低温保鲜技术是一种常见的食品保鲜方法，其原理是通过降低食品的温度，减缓食品中微生物的生长和代谢，从而延长食品的保鲜期。
低温保鲜技术包括冷藏、冷冻、真空包装等多种方法。
冷藏是常用的一种低温保鲜技术，它是将食品存放在低温环境中，一般在0℃~10℃之间。
冷藏可以减缓食品中微生物的生长和代谢，从而延长食品的保鲜期。
但是，冷藏并不能完全杀死微生物，所以冷藏的食品仍然需要在保质期内食用。
除了冷藏，真空包装也是一种常用的低温保鲜技术。
它通过将食品放入密封袋中，将袋内空气抽出，从而形成真空环境。
这种方法可以减缓食品中微生物的生长和代谢，从而延长食品的保质期。
但是，真空包装也会对食品的质量产生影响，如肉类容易变色、蔬菜容易失水等。
总的来说，低温保鲜技术是利用降低食品温度来减缓微生物生长和代谢的方法，从而延长食品的保鲜期。
不同的低温保鲜技术适用于不同的食品和情况，需要根据实际情况选择合适的方法来保持食品的新鲜度和质量。
病毒保存：超低温法
病毒保存：超低温法大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力( 如植物的病原性真菌)，通常可用超低温的方法保存(ATCC 1983;Halliday，Baker 1985)。
此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率(1℃/分钟)冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～-196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。
ATCC 常用一种由甘油(10%)、二甲亚砜(5%)和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。
这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。
当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。
只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。
在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。
这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管，液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
方法(1)剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。
(2)将含有澄清病毒悬液(组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可)冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。
(3)将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
(4)用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。
注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。
(5)再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
(6)将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻(操作时要求戴面罩和手套)。
超低温保存名词解释
超低温保存名词解释超低温保存又称超低温冷冻保存是指将样品在-196 ℃以下保存。
超低温保存与低温保存相比，可以避免样品降解。
由于样品的结构未受破坏，一些生物活性成分仍然存在。
因此，利用超低温保存生物材料，其理化性质比较稳定，这对于防止生物材料的变质、复活等有着重要意义。
当今社会科学技术的发展日新月异，越来越多的样品需要长期储藏而不变质。
目前所能找到的理想的低温保存方法有三种：低温真空保存、超低温冰冻保存和深低温冻藏保存。
低温真空保存通常采用干冰或液氮来冷却样品，样品在低压低温下的结构不易受损伤，在储存过程中无需特殊防护，但保存时间较短，仅适合于短期储藏；超低温冰冻保存采用液态超低温来冷却样品，样品经历低温后不发生冻结现象，样品的生物活性成分和形状得以完好保存，适合于长期保存；深低温冻藏保存则采用液态或固态的深低温技术来冷却样品，使之达到甚至低于绝对零度，达到深低温保存的目的，但同样保存时间很长。
国内外对低温保存的研究及开发应用主要集中在气体、液体和固体样品三个领域。
液体样品包括牛血清白蛋白和血浆等生物材料，它们必须长期保存且不易变质。
为了实现液体样品的长期保存，美国和欧盟在20世纪90年代率先发明了超低温冷冻保存技术。
当超低温液体材料从常温到-150 ℃开始出现结晶冰，再逐渐冷却到-196 ℃以下的储存温度时，就开始出现冰晶转变的过程，在-196 ℃以下冰晶直径达到最大，容易造成细胞膜和蛋白质等重要的生物活性成分破坏，导致保存的材料失去生物活性。
因此，生物材料必须在-196 ℃以下才能长期保存。
我国超低温保存起步较晚，但近几年发展迅速，研究的领域已涉及生物学、医学、化学、物理学、化工和食品等各个领域。
尤其在生物材料的保存上取得了一定进展。
随着我国“ 863”、“ 973”等高技术计划项目的支持，超低温保存研究得到了快速发展，超低温保存已从实验室向工业化方向发展，保存材料也从单一的生物材料发展到蛋白质、多糖、酶、 DNA等多种物质。
生命延续的低温保存技术
生命延续的低温保存技术随着科技的不断进步，我们已经可以将生命延续的时间不断加长，其中低温保存技术就是其中一种有效的手段。
低温保存技术是一种将生命体在极低的温度下保存，并通过注射、植入等方式将其复活的技术。
低温保存技术经过多年的研究与发展，已经在很多领域得到了广泛的应用，其中最为知名的就是人体低温保存技术。
这项技术是将人体在死亡后进行低温保存，以期在未来技术足够先进的时候可以重生。
这项技术虽然仍有很多诟病，但在某些方面已经得到了实际应用，成为了一项绝佳的后备方案。
在人体低温保存技术之外，还有很多其他形式的低温保存技术，例如种子、细胞、组织、器官等的低温保存。
这些技术在很多方面都得到了广泛的应用，例如可以把重要的动植物种子低温保存起来，以应对未来可能出现的种子缺乏等问题。
此外，低温保存技术还被广泛应用于医学、生物工程等领域，用于细胞、组织、器官等的保存。
虽然低温保存技术在某些方面已经得到了广泛的应用，但其技术仍存在很多不足之处。
其中最为严重的问题就是在低温保存过程中，生命体可能会遭受冷冻伤害。
这是由于低温环境下的水分子会凝结成晶体，对细胞膜等生命体组成结构造成破坏。
为了应对这个问题，科学家正在不断探索新的解决方案。
其中最为广泛的方案之一就是使用冷冻保护剂。
这些保护剂能够在低温环境下保护生命体的组成结构，防止其遭受冷冻伤害。
此外，科学家还通过对低温保存的物质进行改良，使其具有更好的保护效果。
这样一来，低温保存技术就可以更加安全、可靠地运用于各个领域。
除了冷冻保护剂之外，科学家还在探索其他形式的低温保存技术。
其中最为令人期待的就是纳米技术的应用。
通过对纳米级物质的有效控制，未来有可能研发出更高效、更精确的低温保存技术。
这将大大推动生命科学和生物医学领域的发展，并在很大程度上改变我们对于生命的认知和理解。
总之，低温保存技术作为一种生命延续的手段，已经得到了广泛的应用，并在未来有着巨大的发展潜力。
我们相信，随着科技的不断进步，低温保存技术将会给我们带来更多的惊喜和机遇。
植物组织培养
45分钟 5 降温冰冻
6 保存后的化冻：一般在37—40 ℃温水浴中快速 化冻
7 活力测定; 通常采用TTC法氯化三苯四氮唑还 原法 如果是单细胞或原生质体;可采用活性荧光 素染色法;显示活细胞;统计存活率
8 再培养;观察组织细胞恢复生长的速度 存活率 植株的再生能力
9 遗传性状的分析：如植株的形态特征 生长发育 状况 染色体 同工酶及抗逆性等
3低温锻炼：如香石竹茎尖经4℃低温预处理14 天;不仅提高了存活率 而且分化率从30％增加 到60％
3 冰冻保护剂
迄今;已经报道了多种类型的冰冻保护剂 常用 的是二甲基亚砜DMSO 甘油 糖和糖醇类物质 氨 基酸 多肽及聚乙二醇等
但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性： 1易溶于水；
2在适当浓度下对细胞无毒；
四 超低温保存的基本设备和程序
1 主要仪器设备 1 用于组织和细胞培养的全套设备； 2 普通电冰箱； 370 ℃ 80℃的低温冰箱； 4 程序降温器；
5 玻璃或塑料试管5ml 或10 m1;封盖严密;不进液 氮；
6 液氮;
7 光学显微镜和紫外荧光显微镜；
8 分光光度计
2 基本程序 1 材料的准备与选择 2 预处理 3 将材料装入试管;并随即插入冰浴中 4 加入0℃预冷的冰保护剂;在0℃冰浴中放置30一
所谓冷冻保存;就是将体外培养物或生物活性材 料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中;以一定 的冷冻速率降至零下某一温度一般是低于700C的超 低温条件;并在此温度下对其长期保存的过程
低温冷冻保存生命技术
低温冷冻保存生命技术低温冷冻保存生命技术是一种先进的生命科学技术，顾名思义，它利用低温的物理原理，将生物体内的细胞、组织、器官等以极低的温度进行保存，以达到延长其寿命，甚至长期保存的目的。
这一技术应用广泛，涵盖了医学、生物科学、科研等多个领域。
下面将为大家详细介绍低温冷冻保存生命技术的步骤。
第一步：准备工作在进行低温冷冻保存之前，必须进行一系列的准备工作。
首先是选择保存对象，该对象必须是无菌的、健康的组织或细胞。
其次是筛选保存温度和冷冻介质，合适的温度和冷冻介质是决定保存质量的关键。
第二步：冷冻过程在冷冻过程中，首先对所要保存的细胞或组织进行保护，使其在与冷冻介质接触的同时不受损伤，而且还要控制冷冻的速度。
之后将细胞或组织放入冷冻液中进行冷冻，该过程要求快速降温，并在适当的时间内达到目标温度。
第三步：保存过程在已经完成冷冻过程后，保存就成为了重中之重。
冷冻样品的保存，主要就是保存在低温环境下。
冷冻完毕后，需要将细胞或组织立即存放到冷冻盒中，严格保证温度的稳定性和密封性。
为了防止冰晶的形成导致对生物体的损伤，需要定期检查样本质量。
第四步：回复生命如果想要使用保存的样本，需要将其回复至正常状态。
一般来说，回复生命需要分三步骤进行。
第一步是快速加热到低于冰点，然后将样品从冷冻条件中快速解冻。
第二步是固定样品，让样品在高温下停留一段时间，以便稳定组织。
第三步是在适当环境下让组织恢复生命。
总之，低温冷冻保存生命技术是一种不可或缺的重要生命科学技术，它为各个行业的使用者带来实用性、高效性和低成本化路径。
随着生命科学技术的不断发展，低温冷冻保存的应用领域将会扩大。
第九章 植物种质资源离体超低温保存 (2 学时)
第九章 植物种质资源离体超低温保存（2学时）教学目的与要求：了解植物种质离体保存的类型与特点；了解超低温保存的特点与方法；植物植物种质低温保存的基本操作技术。
第一节 概 述一、植物种质资源低温保存意义防止资源灭绝节约人力物力便于交流二、超低温保存的概念种质资源低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。
从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。
习惯上，人们将－80ºC以下的低温称为超低温，干冰温度（－70ºC）称为极低温，低温则从4ºC往下推（李广武等，1998）。
对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。
如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。
如甜橙树发生冻害的临界温度通常在－6.5ºC，枳壳通常在－20ºC左右（沈德绪等，1986）。
目前常用的超低温保存方法可分为两类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。
在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。
三、超低温保存的研究概况1．超低温保存技术的发展2．用于离体超低温保存的植物材料3．超低温保存的植物种类超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。
第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60～90％。
细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结。
由于细胞内含有复杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0ºC左右结冰。
理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5～－15ºC，细胞内游离水的冻结在－25ºC。
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1973年，Nag和Street将胡萝卜悬浮培养细胞保存 在液氮中一段时间，解冻后再培养观察到细胞的生长。 这是超低温保存植物材料成功的首次报道。
之后人们对超低温保存技术的研究越来越深入，
尤其对降温方法的研究。 按照待保存材料是否需要包埋，降温方法可分为 两大类： 1 材料不需要包埋的降温方法 2 材料需要包埋的降温方法
2.1.3 材料的脱水方式和保存前的含水量 包埋脱水法保存种质的关键之一是寻找材料包 埋后的最佳脱水方式以及材料保存前最佳含水量， 只有这样才能充分体现包埋这一操作步骤的优点。 包埋后的材料在保存前绝大多数采用干燥空气脱水， 但也可将包埋后蔗糖预处理后的材料用两步法或玻 璃化法作进一步的脱水保存。 对于保存前的最佳含水量，茎尖和分生组织的 最佳含水量为20%～40%，梨茎尖为20%，马铃薯茎 尖为30% 。
一般认为种子、花粉、球茎、抗寒植物 的枝条和冬芽等一些高度脱水的植物材料适 用此法，但对液泡大、细胞含水量高的植物 材料一般不适合。
1.3 两步冰冻法 它是把慢冻和快冻结合起来的一种冰冻方法。 即先用较慢的速度使培养物降至某一温度，停留约 10min或不停留，再降到-40～-30℃，在此温度下 保持30min～1h或不停留直接投入液氮。 目前大多采用每分钟降低0.5～4℃的速率降到40℃，然后投入液氮。一般认为，停留是诱导细胞 外溶液结冰，使细胞内外产生蒸气压差，进行保护 性脱水，否则细胞外有可能产生非均匀的冰晶，对 细胞会产生严重伤害。
目前常用的玻璃化保护剂是Sakai于1991年 推出的保护剂 PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4 mol.L1蔗糖+MS-NH +无激素培养基)。 4 该玻璃化保护剂已在多种植物材料玻璃化冻 存研究中获得成功，并有较高的再生率。
材料需要包埋的降温方法
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 2.2 包埋玻璃化法(encapsulation-vitrifica璃化法保存植物材料的原理 玻璃化法是Luyet于1937年提出的，Sakai等于 1990年建立了玻璃化冻存简单高效的技术体系。
其保存原理： 植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后，快 速投入液氮中保存，使保护剂和细胞内水分来不 及形成冰晶或冰晶没有足够的时间生长，从而进 入一种人工的完全玻璃化的状态。在此状态中， 水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化， 因而不会由于细胞内结冰造成机械损伤或溶液效 应，伤害组织和细胞，保证化冻后细胞仍有活力。
超低温保存技术
超低温保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196℃）中使保存的生物 材料的物质代谢和生长活动几乎完全停止，而细胞活力 和形态发生的潜能仍保存。 这样有利于保存和抢救物种，尽可能避免组织细胞 培养及自然界中积累性突变等的发生，便于国际间的种 质交换。经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高 抗寒性的新材料。 超低温保存正成为长期稳定地保存植物种质资源及 珍贵实验材料的一个重要方法。
1.5 干冻法 利用无菌风、真空、干燥硅胶、饱和盐溶液或 高浓度蔗糖等对材料进行干燥预处理，然后快速将 其投入液氮中保存。在进行干燥预处理时，要适度 脱水和掌握好脱水速度，以增强材料的抗冻性，一 般需要将植物材料的含水量由72%～77%下降到 27%～40%后再浸入液氮中。如果是用无菌风、真空、 干燥硅胶干燥不以任何冷冻保护剂处理的材料，称 为直接干燥处理。
1.6.2 玻璃化冰冻保护剂 在材料冰冻之前，用玻璃化保护剂(Plant Vitrification Solution,PVS)处理，再投入液 氮保存。常用玻璃化保护剂包括渗透性物质和非 渗透性物质两类。 渗透性物质包括甘油、乙二醇、二甲基亚 砜(DMSO)等，非渗透性物质包括蔗糖、聚乙二醇 等物质。此外，脯氨酸也可作为玻璃化保护剂起 到稳定冻存细胞中的蛋白质结构的作用。一般来 说，复合冰冻保护剂能充分发挥各种成分的保护 作用，从而产生累加作用，但其毒性不累加。
1.4 逐步冰冻法 此法是制备不同等级温度的冰浴如-20℃、50℃、-70℃、-100℃或-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等使植物材料经保护剂在0℃预处 理后，逐渐适应这些温度，材料在每级温度上停 留一定时间(4～6min)，使细胞达到保护性脱水， 然后投入液氮中. 殷晓辉通过对几种野生稻愈伤组织冰冻保存 研究，得出的降温程序是：（1）0→-10℃速度 是1℃.min-1停留15min；（2）-10→-40℃速度 是1℃.min-1 ，停留60min；（3）-40→-196℃。
2.2 包埋玻璃化法(encapsulationvitrification) 其基本操作程序：预培养和包埋→玻璃化溶 液脱水→液氮保存→化冻→恢复培养。 这种方法实质上是将包埋脱水法的包埋和玻 璃化法结合在一起，它减少了脱水的时间，简化 了冻存程序，且比包埋脱水法有更高的成芽率。 但是对某些植物而言，包埋玻璃化法不一定 是最适合的，这可能与基因型有关。辣根包埋玻 璃化法冻存3天后，成活率为60%，用包埋脱水法 保存成活率大于90%。
早期的快冻法和慢冻法等常规超低温保存都 是部分玻璃化法即胞内玻璃化。对于单细胞来说， 常规超低温保存中的胞外冰晶几乎是不具有伤害 性的，但对于整个器官或组织来说，所谓的胞外 冰晶仍然是在细胞的间隙中，仍会对细胞产生伤 害。 现在玻璃化法冻存采取完全玻璃化法即胞内 胞外同时为玻璃化状态，在器官和组织水平保存。 对保护细胞与细胞之间的联系方面有较好的效果。 由于是完全玻璃化冻存，因此在解冻时不存在不 均匀化冻现象。
材料不需要包埋的降温方法
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 慢冻法 快冻法 两步冰冻法 逐级冰冻法 干冻法 玻璃化法 （vitrification）
1.1 慢冻法 慢冻法是指以0.1～10℃.min-1的速度进行降 温，只要降温速度适宜，在冰冻保护剂作用下，即 可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因 溶质含量增加引起的“溶液效应”。 原生质体、悬浮培养细胞和愈伤组织等细胞类 型一致的培养物，采用这种方法效果较好。一般来 说，降温速度为0.5～2℃.min-1。
1.2 快冻法 快冻法即将经0℃或其他温度预处理过的材料 直接放入液氮或其蒸气相中，此种方法的降温速度 可达到300～1000℃.min-1，也有人认为可达到 1000℃.min-1以上。 其降温原理：利用超速冷冻，可使细胞内的水 分迅速通过冰晶生成的危险温度区（-140 ～ 10℃），使细胞内的水分来不及形成冰晶中心，就 降到-196℃的安全区。此时细胞内的水为玻璃化状 态，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻 或避免细胞内结冰的危害。
目前迅速恶化的环境和不利的气候条件正 在侵蚀植物的遗传多样性，这种侵蚀正在减 少种内和种间的多样性，使许多生物资源濒 危和正在灭绝。因此保护植物的遗传多样性 已刻不容缓。 科研工作者正在加紧收集种质资源并用适 当的方法予以保存，在众多的方法中，超低 温保存这一方法得到了许多人的青睐。这将 为植物种群有用基因的长期利用提供一条有 效途径。
3 问题与展望 植物种质超低温保存技术具有传统的原境 保存和异境保存无法比拟的优点，它不仅使 保存的材料免受病、虫的侵害，而且能长期 保存生物材料。但是植物超低温保存工作的 开展时间毕竟还短，有许多问题尚需进一步 研究：
（1）冰冻保护剂的选择； （2）降温过程中细胞超微结构的变化； （3）保存几十年的材料遗传稳定性； （4）长期连续使用冻藏的组织再生能力； （5）某一植物保存体系的建立及其普遍应用。 这些是今后一个时期研究的重点，尤其是 保存稀有野生种质和面临绝种的植物，更具有 重要价值。
2.1.1 包埋方式 包埋方式有两种： （1）材料先用高浓度蔗糖预培养后再包埋， 这种方法运用较普遍，褐藻酸钠溶液中可含或不 含高浓度蔗糖。 （2）材料包埋后用更高浓度蔗糖培养处理， 在这种方法中，褐藻酸钠溶液中必须含更高浓度 蔗糖，否则材料会重新回到低渗透状态。
2.1.2 褐藻酸钠和蔗糖的浓度及处理时间 常用褐藻酸钠质量分数为3%，氯化钙浓度100m mol.L-1，固化时间30min,蔗糖浓度一般为0.3 ～ 0.75 mol.L-1，其中以0.75 mol.L-1更常用。 在蔗糖溶液中预培养的时间一般为1d，也有3～ 10d的。
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 包埋脱水法最早出现在法国学者Fabre和 Dereuddre保存马铃薯茎尖的研究中，它参照了 人工种子的制作技术，结合超低温保存的需要， 将包埋和脱水结合起来应用于超低温保存中。
其基本过程： 将包含有材料的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶 液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，同 时辅以高浓度蔗糖预处理材料，使材料获得高 的抗冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降 温方式液氮下保存。
1.1 慢冻法 为均匀分配降温过程中的温度，同质降温待 超低温保存材料，从而减少异质冰晶的形成，提 高保存成功率，出现了演变于慢冻法的微滴冻存 法。其方法是将含有一个茎尖的低温保护剂溶液 滴于铝箔上，用程序降温仪以适宜的速度（一般 在0.1～0.2℃.min-1之间）将其降温至转移温度 （一般为-40～-70℃），最后浸入液氮保存。