9 第九讲2 超低温保存技术

1.5 干冻法 利用无菌风、真空、干燥硅胶、饱和盐溶液或 高浓度蔗糖等对材料进行干燥预处理，然后快速将 其投入液氮中保存。在进行干燥预处理时，要适度 脱水和掌握好脱水速度，以增强材料的抗冻性，一 般需要将植物材料的含水量由72%～77%下降到 27%～40%后再浸入液氮中。如果是用无菌风、真空、 干燥硅胶干燥不以任何冷冻保护剂处理的材料，称 为直接干燥处理。
1.2 快冻法 快冻法即将经0℃或其他温度预处理过的材料 直接放入液氮或其蒸气相中，此种方法的降温速度 可达到300～1000℃.min-1，也有人认为可达到 1000℃.min-1以上。 其降温原理：利用超速冷冻，可使细胞内的水 分迅速通过冰晶生成的危险温度区（-140 ～ 10℃），使细胞内的水分来不及形成冰晶中心，就 降到-196℃的安全区。此时细胞内的水为玻璃化状 态，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻 或避免细胞内结冰的危害。
2.1.3 材料的脱水方式和保存前的含水量 包埋脱水法保存种质的关键之一是寻找材料包 埋后的最佳脱水方式以及材料保存前最佳含水量， 只有这样才能充分体现包埋这一操作步骤的优点。 包埋后的材料在保存前绝大多数采用干燥空气脱水， 但也可将包埋后蔗糖预处理后的材料用两步法或玻 璃化法作进一步的脱水保存。 对于保存前的最佳含水量，茎尖和分生组织的 最佳含水量为20%～40%，梨茎尖为20%，马铃薯茎 尖为30% 。
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 包埋脱水法最早出现在法国学者Fabre和 Dereuddre保存马铃薯茎尖的研究中，它参照了 人工种子的制作技术，结合超低温保存的需要， 将包埋和脱水结合起来应用于超低温保存中。

其基本过程： 将包含有材料的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶 液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，同 时辅以高浓度蔗糖预处理材料，使材料获得高 的抗冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降 温方式液氮下保存。
1.6 玻璃化法 1.6.1 玻璃化法保存植物材料的原理 玻璃化法是Luyet于1937年提出的，Sakai等于 1990年建立了玻璃化冻存简单高效的技术体系。

其保存原理： 植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后，快 速投入液氮中保存，使保护剂和细胞内水分来不 及形成冰晶或冰晶没有足够的时间生长，从而进 入一种人工的完全玻璃化的状态。在此状态中， 水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化， 因而不会由于细胞内结冰造成机械损伤或溶液效 应，伤害组织和细胞，保证化冻后细胞仍有活力。
1973年，Nag和Street将胡萝卜悬浮培养细胞保存 在液氮中一段时间，解冻后再培养观察到细胞的生长。 这是超低温保存植物材料成功的首次报道。
之后人们对超低温保存技术的研究越来越深入，
尤其对降温方法的研究。 按照待保存材料是否需要包埋，降温方法可分为 两大类： 1 材料不需要包埋的降温方法 2 材料需要包埋的降温方法
目前迅速恶化的环境和不利的气候条件正 在侵蚀植物的遗传多样性，这种侵蚀正在减 少种内和种间的多样性，使许多生物资源濒 危和正在灭绝。因此保护植物的遗传多样性 已刻不容缓。 科研工作者正在加紧收集种质资源并用适 当的方法予以保存，在众多的方法中，超低 温保存这一方法得到了许多人的青睐。这将 为植物种群有用基因的长期利用提供一条有 效途径。
超低温保存技术
超低温保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196℃）中使保存的生物 材料的物质代谢和生长活动几乎完全停止，而细胞活力 和形态发生的潜能仍保存。 这样有利于保存和抢救物种，尽可能避免组织细胞 培养及自然界中积累性突变等的发生，便于国际间的种 质交换。经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高 抗寒性的新材料。 超低温保存正成为长期稳定地保存植物种质资源及 珍贵实验材料的一个重要方法。

一般认为种子、花粉、球茎、抗寒植物 的枝条和冬芽等一些高度脱水的植物材料适 用此法，但对液泡大、细胞含水量高的植物 材料一般不适合。
1.3 两步冰冻法 它是把慢冻和快冻结合起来的一种冰冻方法。 即先用较慢的速度使培养物降至某一温度，停留约 10min或不停留，再降到-40～-30℃，在此温度下 保持30min～1h或不停留直接投入液氮。 目前大多采用每分钟降低0.5～4℃的速率降到40℃，然后投入液氮。一般认为，停留是诱导细胞 外溶液结冰，使细胞内外产生蒸气压差，进行保护 性脱水，否则细胞外有可能产生非均匀的冰晶，对 细胞会产生严重伤害。
1.1 慢冻法 为均匀分配降温过程中的温度，同质降温待 超低温保存材料，从而减少异质冰晶的形成，提 高保存成功率，出现了演变于慢冻法的微滴冻存 法。其方法是将含有一个茎尖的低温保护剂溶液 滴于铝箔上，用程序降温仪以适宜的速度（一般 在0.1～0.2℃.min-1之间）将其降温至转移温度 （一般为-40～-70℃），最后浸入液氮保存。
1.4 逐步冰冻法 此法是制备不同等级温度的冰浴如-20℃、50℃、-70℃、-100℃或-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等使植物材料经保护剂在0℃预处 理后，逐渐适应这些温度，材料在每级温度上停 留一定时间(4～6min)，使细胞达到保护性脱水， 然后投入液氮中. 殷晓辉通过对几种野生稻愈伤组织冰冻保存 研究，得出的降温程序是：（1）0→-10℃速度 是1℃.min-1停留15min；（2）-10→-40℃速度 是1℃.min-1 ，停留60min；（3）-40→-196℃。
目前常用的玻璃化保护剂是Sakai于1991年 推出的保护剂 PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4 mol.L1蔗糖+MS-NH +无激素培养基)。 4 该玻璃化保护剂已在多种植物材料玻璃化冻 存研究中获得成功，并有较高的再生率。
材料需要包埋的降温方法
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 2.2 包埋玻璃化法(encapsulation-vitrification)
2.1.1 包埋方式 包埋方式有两种： （1）材料先用高浓度蔗糖预培养后再包埋， 这种方法运用较普遍，褐藻酸钠溶液中可含或不 含高浓度蔗糖。 （2）材料包埋后用更高浓度蔗糖培养处理， 在这种方法中，褐藻酸钠溶液中必须含更高浓度 蔗糖，否则材料会重新回到低渗透状态。
2.1.2 褐藻酸钠和蔗糖的浓度及处理时间 常用褐藻酸钠质量分数为3%，氯化钙浓度100m mol.L-1，固化时间30min,蔗糖浓度一般为0.3 ～ 0.75 mol.L-1，其中以0.75 mol.L-1更常用。 在蔗糖溶液中预培养的时间一般为1d，也有3～ 10d的。
1.6.2 玻璃化冰冻保护剂 在材料冰冻之前，用玻璃化保护剂(Plant Vitrification Solution,PVS)处理，再投入液 氮保存。常用玻璃化保护剂包括渗透性物质和非 渗透性物质两类。 渗透性物质包括甘油、乙二醇、二甲基亚 砜(DMSO)等，非渗透性物质包括蔗糖、聚乙二醇 等物质。此外，脯氨酸也可作为玻璃化保护剂起 到稳定冻存细胞中的蛋白质结构的作用。一般来 说，复合冰冻保护剂能充分发挥各种成分的保护 作用，从而产生累加作用，但其毒性不累加。
早期的快冻法和慢冻法等常规超低温保存都 是部分玻璃化法即胞内玻璃化。对于单细胞来说， 常规超低温保存中的胞外冰晶几乎是不具有伤害 性的，但对于整个器官或组织来说，所谓的胞外 冰晶仍然是在细胞的间隙中，仍会对细胞产生伤 害。 现在玻璃化法冻存采取完全玻璃化法即胞内 胞外同时为玻璃化状态，在器官和组织水平保存。 对保护细胞与细胞之间的联系方面有较好的效果。 由于是完全玻璃化冻存，因此在解冻时不存在不 均匀化冻现象。
3 问题与展望 植物种质超低温保存技术具有传统的原境 保存和异境保存无法比拟的优点，它不仅使 保存的材料免受病、虫的侵害，而且能长期 保存生物材料。但是植物超低温保存工作的 开展时间毕竟还短，有许多问题尚需进一步 研究：

（1）冰冻保护剂的选择； （2）降温过程中细胞超微结构的变化； （3）保存几十年的材料遗传稳定性； （4）长期连续使用冻藏的组织再生能力； （5）某一植物保存体系的建立及其普遍应用。 这些是今后一个时期研究的重点，尤其是 保存稀有野生种质和面临绝种的植物，更具有 重要价值。
2.2 包埋玻璃化法(encapsulationvitrification) 其基本操作程序：预培养和包埋→玻璃化溶 液脱水→液氮保存→化冻→恢复培养。 这种方法实质上是将包埋脱水法的包埋和玻 璃化法结合在一起，它减少了脱水的时间，简化 了冻存程序，且比包埋脱水法有更高的成芽率。 但是对某些植物而言，包埋玻璃化法不一定 是最适合的，这可能与基因型有关。辣根包埋玻 璃化法冻存3天后，成活率为60%，用包埋脱水法 保存成活率大于90%。
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材料不需要包埋的降温方法
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 慢冻法 快冻法 两步冰冻法 逐级冰冻法 干冻法 玻璃化法 （vitrification）
1.1 慢冻法 慢冻法是指以0.1～10℃.min-1的速度进行降 温，只要降温速度适宜，在冰冻保护剂作用下，即 可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因 溶质含量增加引起的“溶液效应”。 原生质体、悬浮培养细胞和愈伤组织等细胞类 型一致的培养物，采用这种方法效果较好。一般来 说，降温速度为0.5～2℃.min-1。