病原学检查

Antibiotic interactions with gram negative organisms
Cephalosporins
slower diffusion due to bulk and ionic charges
Imipenem
Rapid diffusion due to small size and zwitterionic +/- charge)
㈠血 液
• • • • • 发热初期和高峰期采集 抗菌药物治疗前 成人每次10-20ml，婴幼儿1-5ml 专用血培养瓶 24小时内，可在不同部位采血3次
Chills 寒战
Blood Cultures
血培养
BACTEREMIA LEVEL 菌血症的水平
Temp 体温
0
30 Time (min)
60
•
用拭子采样，亦可在局部麻醉后取 角膜刮屑
二.病原体检查的基本方法
1.临床标本细菌检验一般程序
一般程序
标本
直接涂片，染色镜检 需氧培养 分离培养 二氧化碳培养 观察菌落形态 单个菌落 血清学鉴定 生化鉴定 确定致病菌发出报告 涂片、染色镜检 药敏试验 增菌培养 厌氧培养
原体诊断的基本方法
直接显微镜检测（microscopic examination） ⑴染色标本检查法：革兰染色和抗酸染色 ⑵不染色标本检查法：悬滴法和压滴法
一、流行病学和临床类型
• Clinical types: 1.Acquired immunodeficiency syndrome（AIDS） 2.Syphilis⑴初期梅毒⑵二期梅毒⑶三期梅毒 3.Gonorrhea：淋病奈瑟菌 4.Non-gonococcal urethritis（NGU） 5.Genital herpes： HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ Condyloma acuminatum：HPV 6.Chancroid：杜克雷嗜血杆菌
第二节
病原体耐药性检测
一.抗菌药物敏感性试验（AST）
1.定义：体外检测抗菌药物抑制或杀灭细菌 的能力，亦即是检测细菌对抗菌药物敏感 性(或耐药性)。
一.抗菌药物敏感性试验（AST）
2.目的 • 预测抗菌药物治疗的效果 • 更换抗菌药物时，预测拟选药物的疗效 • 对常见病原菌耐药状况监测 • 评价抗菌药物抗菌谱及抗菌效果
二、耐药性检测试验
3.病原体耐药基因的测定 分子生物学技术：PCR法、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、生物芯片技术和自动测序技术
耐药性统计和分析
WHONET
100 80 60 40 20 0 东部 西部 北部
建立本院、本地区和本国的细菌耐药性监 测数据库和网络
第一季度 第二季度 第三季度 第四季度
二、检查项目和临床应用
• 真菌感染(fungi infection) 1.直接检查：孢子与菌丝 2.分离培养 3.血清学检测 4.分子生物学检查
二、检查项目和临床应用
• 其他病原体感染： 1.支原体检测：分离培养和分子生物学技术 2.螺旋体检测：暗视野显微镜检、血清学检测 3.立克次体检测 4.衣原体检测：分离培养 5.严重急性呼吸道综合征（SARS）病毒的检测： 免疫学方法、基因检测、细胞培养
二、HBV标志物测定
• • • • HBV 蛋白前S1和前S1抗体测定 HBV 蛋白前S2和前S2抗体测定 乙肝 DNA测定 乙肝 YMDD变异测定
三、HCV标志物测定
• HCV RNA测定：阳性提示 HCV复制活跃，传染性强 • 抗-HCV IgM测定：阳性提示病毒持续存在并有复 制 • 抗-HCV IgG测定：输血后肝炎阳性达80-90%
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑵青霉素结合蛋白改变所致耐药的检测 ①耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固 酶阴性葡萄球菌（MRSCoN）的检测 头孢西丁（30μ g）纸片筛选（CLSI 2007年） 意义:MRSA对全部-内酰胺类抗菌药物,包括青霉素和头孢菌 素以及其他抗菌药物均耐药,仅糖肽类抗生素有效 ②高度耐青霉素和氨苄西林肠球菌检测 ③耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）检测
㈤脑脊液与其他无菌体液
• 脑脊液标本应立即保温送检 • 胸腹水等体液标本应抽取2-5ml送检
㈥泌尿生殖道标本
• 性传播疾病取尿道口分泌物、阴道宫颈口 分泌物 • 生殖道疱疹常穿刺取疱疹液
㈦创伤、组织和脓肿标本 • 开放性脓肿：无菌棉拭采集脓液 • 封闭性脓肿：无菌注射器穿刺抽取
㈧眼、耳部标本
临床病原学检查
[目的要求]
掌握：感染性疾病的诊断和治疗原则 熟悉：感染性疾病病原学实验诊断及抗生素 治疗的主要实验室监测方法 了解：病原学诊断的重要性，院内感染监测
病原体检查的作用
1.感染性疾病的明确诊断 2.通过药敏试验指导临床合理用药 3.病原体监控和耐药性监控
.标本采集和运送
• 采集标本注意点： 1.标本容器必须无菌或清洁容器 2.选择最佳时间采集标本，在抗菌药物使用前 3.获取标本时，须严格无菌操作 4.标本采集后，应尽快送实验室
第四节
病毒性肝炎检测
病毒性肝炎分类
• • • • • • • Hepatitis A Virus（HAV） Hepatitis B Virus （HBV） Hepatitis C Virus （HCV） Hepatitis D Virus （HDV） Hepatitis E Virus （HEV） Hepatitis G Virus （HGV） Transfusion Transmitted Virus（TTV）
第三节 临床感染常见病原体检测
一、流行病学和临床类型
• 流行病学特点： 1.疾病谱发生变迁，新传染病陆续被发现 2.多重耐药株出现，导致抗感染治疗失败 3.医院感染及条件致病菌感染增加 • 临床类型： 细菌感染、病毒感染、真菌感染
二、检查项目和临床应用
• 细菌感染(bacteria infection) 1.检测细菌或其抗原(antigen) 2.检测抗体(antibody) 3.检测细菌遗传物质(DNA) • 病毒感染(virus infection) 1.病毒分离与鉴定：细胞培养(culture) 2.病毒核酸与抗原的直接检测(DNA、antigen) 3.特异性抗体检测(antibody)
四、其他肝炎病毒标志物测定
• • • • HDV：HBV或其他嗜肝病毒的辅助下才能复制和传播 HEV：主要粪-口传播 HGV：易见于输血后肝炎 TTV：
transmitted disease）检测
第五节 性传播疾病病原体（sexually
一、流行病学和临床类型
• Epidemiology 1.病原学：细菌、病毒、支原体、螺旋体、衣原体和真菌等 2.传播途径： ⑴性行为传播 ⑵间接接触传播 ⑶血液与血制品传播 ⑷对胎儿与新生儿传播 ⑸职业性传播
二.耐药机制及耐药性监测试验
③ 头孢菌素酶(AmpC酶)的检测：Ｉ型-内酰胺酶，可由染 色体或质粒介导，可水解大多数青霉素，第一、第二、第 三代头孢菌素和单环类抗生素。第四代头孢菌素和碳青霉 烯类抗生素对AmpC酶稳定。
二.耐药机制及耐药性监测试验
④金属酶检测：３型酶，需要金属离子Zn2+作为辅因子才具 有活性能水解包括碳青霉烯在内的几乎所有-内酰胺类抗 生素。
OmpF OmpC
Beta Lactamases
(hydrolyzing enzymes)
penicillin binding proteins
PBP3 PB1b
CBD/RR
PBP2
PBP1a
二.耐药机制及耐药性监测试验
2.耐药菌监测试验
⑴ 酶介导的耐药性检测 ①直接-内酰胺酶检测
方法:头孢哨噻吩滤纸片法(nitrocefin) 意义: -内酰胺酶检测阳性,即对青霉素、氨苄西林等抗生素 耐药
二、检查项目和临床应用
• AIDS 病原体测定 1.抗HIV-1和HIV-2检测 ⑴颗粒凝集试验 ⑵酶联免疫吸附试验（ELISA/EIA） ⑶免疫荧光法 ⑷蛋白印迹法
二、检查项目和临床应用
• AIDS病原体测定 2.抗原检测 ⑴病毒培养：敏感性差、操作时间长、操作复杂 ⑵p24抗原检测 ⑶HIV RNA 检测：灵敏度高、病程监控等 3.其他实验室检查 ⑴CD4细胞计数 ⑵其他病原体检测
一、HAV标志物检测
• Antigen测定 • Antibody测定(IgM、IgA、IgG) • HAV-RNA测定 主要检测方法：ELISA法 临床意义：抗HAV IgM 阳性、抗HAV IgA阳性、 抗HAV IgG 阳性
二、HBV标志物测定
• 乙肝六项测定阳性及临床意义 HBsAg：急性HBV感染早期，HBV复制活跃 抗-HBs：保护性抗体，HBV感染恢复期 HBeAg：HBV复制活跃，传染性强 抗-HBe：复制减少，传染性降低 HBcAg：血清中不易检测出，可产生抗-HBc抗体 抗-HBc： 抗-HBc-IgM与临床抗生素剂量关系 敏感(S)——一般剂量有效，推荐使用该抗生素用于临床治疗 中介(I)——大剂量有效，提示药物MIC接近体液或组织可达 到药物浓度 耐药(R)——大剂量无效,即常规用药剂量不能达到MIC
二.耐药机制及耐药性监测试验
㈠耐药病原体 G- bacterial: -内酰胺酶介导的耐-内酰胺类抗生素的革兰阴性菌 质粒介导的产超广谱-内酰胺酶（ESBL）的ECO,KPN 染色体编码产生Ⅰ类-内酰胺酶的ECL,EAE 多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌和不动杆菌
原体诊断的基本方法
病原体分离培养(isolation and culture)和鉴定
(identification)
培养基选择 • 生长条件：一般大气条件 厌氧条件 微需氧条件
病原体诊断的基本方法
• • • • 鉴定技术： 生化鉴定 血清学鉴定 数码鉴定 自动化鉴定
原体诊断的基本方法
血清学诊断：查特异性抗体——肥达氏试验 病原体特异性抗原检测 病原体核酸检测：查特异基因片段DNA/RNA——PCR （荧光定量）、DNA探针杂交技术、基因芯片技术
二.耐药机制及耐药性监测试验
②超广谱-内酰胺酶检测（ESBL） 定义：是水解青霉素，一代、二代和三代头孢菌及单酰胺类 药物的酶，被克拉维酸所抑制。 ESBL主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌中。
二.耐药机制及耐药性监测试验
②超广谱-内酰胺酶检测（ESBL） 方法：纸片扩散法和稀释法 意义：ESBL阳性预示对头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻肟、 头孢曲松和氨曲南等抗菌药物无效。
Renji Hospital
尿 液
• 无菌采集清洁中段尿 • 导尿或膀胱穿刺获得
㈢粪 便
• 取含脓、血或粘液粪便置于清洁容器内 • 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子 • 对传染性腹泻须三次送检
㈣呼吸道标本
1.痰：⑴自然咳痰法 ⑵气管镜采集法 2.鼻咽拭标本：同痰标本用清水漱口后采集 注意：唾液为不合格的痰标本，不应送实 验室检测
二、检查项目和临床应用
• 梅毒病原体测定 1.暗视野显微镜检查 2.梅毒血清学试验 ⑴非梅毒螺旋体抗原试验：VDRL、RPR、TRUST ⑵梅毒螺旋体抗原试验：FTA-ABS、TPHA 3.脑脊液检查：VDRL试验阳性 4.TP-PCR
一.抗菌药物敏感性试验（AST）
3.常用敏感性试验方法 ⑴手工试验:①K-B纸片琼脂扩散法 结果表示:S-Susceptible I-Intermediate R-Resistant ②稀释法（MIC） ③Etest ④耐药筛选试验
一.抗菌药物敏感性试验（AST）
⑵自动化仪器 Vitek，Microscan ⑶分子试验 PCR直接检测mecA基因 ⑷补充试验 Nitrocefin
二.耐药机制及耐药性监测试验
㈠耐药病原体 G+ bacterial: 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） 耐青霉素肺炎链球菌（PRSP） 耐万古霉素肠球菌（VRE） 高耐氨基糖苷类抗生素肠球菌
二.耐药机制及耐药性监测试验 1.耐药机制： ⑴产生灭火酶和钝化酶(-内酰胺酶) ⑵药物作用靶位点改变：抗生素结合蛋白发 生改变（PBP） ⑶细胞外膜通透性改变（减少或突变） ⑷细菌膜外排泵出系统