第五节 中和试验

第十一章血清学试验

第五节中和试验

根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。

体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。

体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。

毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。

一、终点法中和试验

终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。

(一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。

1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈

直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD

50)作为毒价单位，而且LD

50

的计算应

用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作为指标

的，可用半数感染量(ID

50)。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD

50

)或鸡胚

半数感染量(EID

50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID

50

)。在

测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD

50)或半数保护量(PD

50

)。

2.病毒毒价测定将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3……，选择4～6个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组3～6只(个、孔)。接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。

以TCID

50

测定为例说明如下：

按Karber法计算，其公式为lgTCID

50

=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组死亡（感染）数/试验数相加。

若以测定某种病毒的TCID

50

为例，病毒作10-4～10-7稀释，记录其出现细胞病变（CPE）的情况（表11-1）。则L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16

lgTCID

50=(-4)+(-1)×(2.16-0.5)=-5.66。TCID

50

=10-5.66，0.1ml。

TCID

50

为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.66（1/105.66）时，每孔细胞接种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少

TCID

50或（LD

50

等）表示。如上述病毒的毒价为105.66TCID

50

/0.1ml，即106.66TCID

50

/ml。

3.正式试验将病毒原液稀释成每一单位剂量含200LD

50(或EID

50

、TCID

50

)，

与等量递进稀释的待检血清混合，置37℃感作1h。每一稀释度接种3～6只（个、

管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组动物的存活数和死亡数，同样按

Reed-Muench法或Karber法计算其半数保护量（PD

50

），即该血清的中和价。

(二)固定血清稀释病毒法将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列无菌试管，第一列加等量正常血清(对照组)，第二列加等量待检血清(中和组)；混合后置37℃感作1h，每一稀释度接种3～6只试验动物(或鸡胚、组织细胞)，记录每

组动物死亡数、累积死亡数和累积存活数（表11-2），按Karber法计算LD

50

，

然后计算中和指数。中和指数=中和组LD

50/对照组LD

50

。按表11-3的结果：中和

指数=10-2.2/10-5.5=103.3，查3.3的反对数为1995，即103.3=1995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1994倍。通常待检血清的中和指数大于50者即可判为阳性，10～40为可疑，小于

10为阴性。

二、空斑减数试验（Plague reduction test）

空斑或蚀斑是指把病毒接种于单层细胞，经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态。空斑减数试验是应用空斑技术，使空斑数减少50%的血清稀释度为该血清的中和效价。试验时，将已知空斑形成单位（PFU）的病毒稀释