Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5×SDS-PAGE)

SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法

SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

SDS-PAGE标准操作规程

SDS—PAGE标准操作规程一、试剂（一)储存液(1)2M Tris-HCl （pH8.8),100ml称取24.2g Tris碱；加50ml蒸馏水;缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高;加蒸馏水至100ml.(2)1M Tris—HCl（pH6.8）,100ml称取12。

1g Tris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH6。

8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml.(3)10%(w/v)SDS，100ml。

室温保存称取10g的SDS；加蒸馏水至总量为100ml.(4)50%（v/v）甘油，100ml倒取50ml 100%的甘油；加入50ml蒸馏水。

(5)1%(w/v)溴酚蓝，10ml称取100mg溴酚蓝；加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。

（二)工作液(1)30％（w/v)丙烯酰胺/0。

8%（w/v）双丙烯酰胺30g丙烯酰胺0.8g双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml,缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45μm滤膜。

可在4℃存放数月。

(2)4×Tris-Cl/SDS (pH8。

8 1。

5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS)91g Tris base2g SDS加水300ml,用1N HCl调pH至8.8,再加水至500ml过0.45μm滤膜，4℃存放(3)4×Tris-Cl/SDS (pH6.8 0.5M Tris—Cl Containing 0.4%SDS)6。

05g Tris base0.4g SDS加水40ml，用1N HCl调pH至6。

8，再加水至100ml过0.45μm滤膜，4℃存放(4)10％过硫酸铵APS0.1g过硫酸铵1ml蒸馏水长期不用应-20℃干燥分装保存，临用前再加D。

Westernblot所需溶液的配制

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。

注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。

电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。

蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE 测量蛋白分子量所需试剂及仪器：试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。

仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。

母液：1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。

高压灭菌处理。

2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。

高压灭菌处理。

3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。

4、50%（w/v）甘油100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。

5、1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。

6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。

7、1M DTT20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml/份，-20℃保存。

工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml。

0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。

pH≤7.0。

2、4×分离胶缓冲液（B液）100ml： 75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)4ml 10%SDS21ml蒸馏水4℃存放。

3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml： 50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)4ml 10%SDS46ml蒸馏水4℃存放。

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书Cat.No：Lot No：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。

SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。

聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。

由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。

蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。

凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。

两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。

由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质。

试剂盒组成：1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml4．10%SDS 30ml5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml6．去离子水250ml7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml9．考马斯亮蓝染色剂50ml10. 考马斯亮蓝脱色剂250ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1：4稀释，配成1×-甘氨酸电泳缓冲液工作液。

凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏（2）进行分离胶的配制（3）加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）再在胶液面上小心注入一层水（约2—3mm高）以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。

SDS-PAGE原理、方法详解

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。

用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。

丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。

丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量时必须戴手套和面具。

）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。

配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。

4℃保存。

（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。

配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。

SDS-PAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr）29。

0g，亚甲基双丙烯酰（Bis)1。

0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；2）1。

5M Tris—HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8。

0，定容至100mL；3) 1M Tris—HCl（pH 6。

8）：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8，定容至100 mL；4）4⨯分离胶缓冲液：0。

4gSDS溶于1.5M Tris—HCl（pH 8。

8），定容至100mL;5) 4⨯浓缩胶缓冲液: 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6。

8），定容至100mL;6）10⨯电泳缓冲液(pH 8.3）：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解，定容至100mL；7) 10％过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液:1M Tris-HCl(pH 6.8）2。

5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0。

6g，甘油2。

0 mL，0。

1％溴酚兰1。

0 mL,ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501。

25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL;10）脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11) 分离胶(12。

5%)：ddH2O 4mL，30％储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL，10% Aps 0。

1mL(现配），TEMED（N，N,N'，N’—四甲基乙二胺）10μL;12）浓缩胶（5％）:ddH2O 2.65mL，30％储备胶0。

85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1。

25mL，10%Aps 50μL,TEMED 5μL.Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸)- SDS —PAGE蛋白质电泳1 Tricine —SDS —PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1。

SDS电泳溶液的配置

SDS-PAGE电泳溶液的配置
1、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
试剂
浓度
称重
备注
Tris
0.125 M
15.1g
加入800 ml的双蒸水溶解，
定容至1 L，室温保存
甘氨酸（Glycine）
1.25 M
94g
SDS
0.5%（W/V）
5g
2、染色液
试剂
浓度
称重
备注
乙醇
25%（V/V）
250 mL
双蒸水溶解，定容至1 L，滤纸过滤后，室温保存
冰醋酸
8%（V/V）
80 mL
考马斯亮蓝
0.25%
2.5g
3、脱色液
试剂
浓度
称重
备注
乙醇
25%（V/V）
250 mL
定容至1 L，室温保存
冰醋酸
8%（V/V）
80 mL
4、30%丙烯酰胺混合液（29：1）
试剂
浓度
称重
备注
丙烯酰胺
29%（W/V）
29g
加热溶于60 ml双蒸水中，定容至100ml，滤纸过滤，棕色瓶室温保存
9、浓缩胶缓冲液（pH6.8）－0.5mol/L Tris－HCl
试剂
浓度
称重
备注
Tris
0.5mol/L
6.06g
调pH6.8，定容至100ml，
滤纸过滤，室温保存
1mol/L HCl
48%V/V）
48 ml
注：或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml.
10、5×上样缓冲液
试剂
浓度
称重
备注
0.5mol/LTris－HCl（pH6.8）

SDS-PAGE 操作标准

SDS-PAGE 操作标准一、电泳相关溶液的配制：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml ）：丙稀酰胺 29g （实际可以为29.2g ）双丙稀酰胺 1g （实际可以为0.8g ）用水溶解定容到100ml ，过滤，4摄氏度保存一个月。

2、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：5× 1×Tris base 15.1g 25mmol/L 甘氨酸 94g 250mmol/L （pH8.3） 10%SDS （m/V ） 50mL 0.1%（m/V ） dH2O 定容至1000ml 。

3、2×SDS 凝胶加样缓冲液：1.0 mol/L pH6.8 Tris-Cl 10 mL 1.0 mol/L 二硫苏糖醇(DTT ) 20 mLSDS 4g 溴酚蓝 0.2g 甘油 20mL加水定容至100mL ，于4℃保存。

注：1.0 mol/L DTT 可替换为10% β-巯基乙醇 4、染色液的配制（1000ml ）: 甲醇或者乙醇 500ml2010.06.28药物部王红勋乙酸 100ml考马斯亮蓝R250 2.5g，去离子水补至1000ml。

充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。

当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。

5、脱色液（1000ml）:甲醇或者乙醇 250ml乙酸 80ml去离子水补至1000ml,混匀，备用。

二、SDS-PAGE分析：1、20uL收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。

表一：SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围：丙烯酰胺浓度/% 线性分离范围/kDa15 10-4312 12-6010 20-807.5 36-945.0 57-212注：丙烯酰胺:双丙烯酰胺的分子比=1:29表二、5%浓缩胶配方（积层胶、压缩胶）配制不同体积凝胶所需要各成份的体积/mL成份1 2 3 4 5 6 8 10 5%浓缩胶水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺混合溶液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.71.0mol/Tris（pH6.8） 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.2510%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1TEMED 0.0010.0020.0030.0040.0050.006 0.008 0.01表三：分离胶配方配制不同体积和浓度凝胶所需要各成份的体积/mL 成份5 10 15 20 25 30 40 50 6%胶水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺混合溶液 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0040.0080.0120.0160.02 0.024 0.032 0.04 8%胶水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 16.5 23.2 30%丙烯酰胺混合溶液 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.31.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0030.0060.0090.0120.0150.018 0.024 0.03 10%胶水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺混合溶液 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.71.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.02 12%胶水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺混合溶液 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.01 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.01 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.02 15%胶水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%丙烯酰胺混合溶液 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.022、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。

SDS-PAGE电泳技术

4.4试剂和溶液（以下所用试剂均为分析纯级）4.4.1 纯化水4.4.2 A液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：称取18.17g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.8，加纯化水定容至100ml。

4.4.3 B液（30%丙烯酰胺）：称取29.1g丙烯酰胺，0.9 g N,N’-甲叉双丙烯酰胺于100ml 烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤，避光4℃保存。

4.4.4 C液（10%SDS）：称取10g SDS于100ml烧杯中，加纯化水溶解，用量筒定容至100ml。

4.4.5 D液：10%过硫酸铵溶液（4℃保存有效期为3个月）。

4.4.6 E液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：称取12.11g Tris加80ml纯化水溶解，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8，加纯化水定容至100ml。

4.4.7 电极缓冲液母液（5×），称取15.1g Tris，94.0g甘氨酸，5.0g SDS加800ml纯化水溶解，用6mol/L盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。

4.4.8 电极缓冲液，量取200ml电极缓冲液母液，加700ml纯化水稀释，再用6 mol/L 盐酸调pH值至8.3，加纯化水定容至1000ml。

4.4.9 供试品缓冲液，称取0.303g Tris，0.189ml盐酸，4ml甘油，0.002g溴酚蓝，0.8g SDS，加纯化水定容至10ml，此溶液用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2ml β-巯基乙醇；4℃保存。

4.4.10 考马斯亮蓝染色液，称取1.25g考马斯亮蓝R-250，250ml甲醇，50ml冰醋酸，加纯化水溶解至500 ml。

4.4.11 考马斯亮蓝脱色液，量取150ml 95%乙醇，75ml冰醋酸，加纯化水至1000 ml。

Westernblot所需溶液的配制

.WB所需溶液的配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,CHONaS）41225溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; )的配置过硫酸铵称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

加HCl调pH到7.6，室温储存。

1 / 3.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris1:21:1或H2O 32ml混匀备用。

按3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，12.8ml，巯基乙醇，总蛋20-25ul3min比例与蛋白质样品混nonfat dried milk 或者0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide丽春红溶液：12 10毫升。

微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至100 毫升）（10004%1）多聚甲醛（PFA）的配制微升氢氧化钠，全300毫升水，60度搅拌溶解，加入40克多聚甲醛，加入800毫升。

调1000PBS，加水定容到度，再加入100毫升的10×部溶解后冷却到4 4。

通风橱过滤，度保存。

pH到7.2-7.4步骤：；至7.4pH0.2%NaOHEDTA,10-20首先加毫升的水溶解再加入使溶解，再调应溶解一个再加另外一个；然后分别加入其他成分，去氧胆酸钠开盖后会飞出，2 / 3.戴口罩。

SDS-PAGE蛋白电泳手册

蛋白电泳手册SDS—PAGE及Western blot蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。

根据所采用的支持物不同，有琼脂糖凝胶电泳，淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE）由于无电渗作用，样品用量少（1-100μg),分辨率高，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。

PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。

SDS—PAGE原理SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质—SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

实验使用过程中，还加入DTT或者*＊＊，以打开蛋白间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。

SDS-PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。

索引蛋白电泳（SDS-PAGE）……………………电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………上样及电泳……………………染色蛋白提取蛋白定量Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准(图）考马斯蛋白胶快速染色液Western blotWestern blotting DAB检测试剂盒Western blotting ECL化学发光检测试剂盒Western blotting 试剂盒使用说明蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号货号名称1T8060TRIS 三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine 甘氨酸3S8010SDS 十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide 丙烯酰胺5M8200N，N-Methylene Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6A8090Ammonium Persulfate 过硫酸胺7D8220DTT 二硫苏糖醇8M8210β—Mercaptoethanol β-**＊9T8090TEMED 四甲基＊**10A101030％丙烯酰胺（29：1)11S10514XSDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8。

SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDSPAGE之五兆芳芳创作30%聚丙烯酰胺溶液30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制办法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml.0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管.严格核实PH不得超出7.0，因可以产生脱氨基反响是光催化或碱催化的.使用期不得超出两个月，隔几个月须重新配制.如有沉淀，可以过滤.【保管条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性.称量丙烯酰胺和N,N’亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具.可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操纵，因为它还可能含有少量未聚合伙料.1MTrisHCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTrisHCL【配制办法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4大约0.7mL，7.6大约0.6mL，8.0大约0.42mL），将溶液定容至1L，低温高压灭菌后，室温保管.应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变更差别很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约下降0.03个单位.【保管条件】室温保管.【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护.1.5MTrisHCL（pH8.8）(别离胶buffer)【配制办法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，低温高压灭菌后，室温保管.（1.5mmol/LTrisHCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混杂，加水稀释到100ml终体积.过滤后40C保管.）【保管条件】室温保管【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变更差别很大，温度每升高1℃，溶液的pH 值大约下降0.03个单位.10%十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS【配制办法】称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，参加约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保管【保管条件】室温保管【注意事项】保管条件： 4℃保管. 注意事项：易燃，有腐化性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和安康，请穿实验服并戴一次性手套操纵.保管条件：4℃保管. 注意事项：易燃，有腐化性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和安康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护.10%过硫酸铵溶液10%(w/v)AP【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵【配制办法】称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水吹打溶解，4℃保管【保管条件】4℃保管【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保管时，可使用2周左右，超出期限会失去催化作用5×Tris甘氨酸电泳缓冲液 5×TrisGlycine buffer （SDSPAGE 电泳缓冲液）【组分浓度】【配制办法】称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保管.得0.125mol/L Tris1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液.临用前稀释5倍.【保管条件】室温保管，两年有效.【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超出两周.电泳缓冲液可以收受接管，收受接管后可再使用12次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液.5×SDSPAGE加样缓冲液 5×SDSPAGE Loading Buffer【组分浓度】0.25MTrisHCL(pH6.8)；10%(W/V)SDS；0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝)；50%(V/V) 甘油；5%(W/V)β巯基乙醇(2ME)【配制办法】量取 1.25mL 1MTrisHCL（pH6.8），0.5g SDS，25mg BPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保管.使用前将25μL的2ME参加到每小份中.参加2ME的Loading Buffer可在室温下保管一个月左右.【保管条件】20℃保管，至少一年有效.【注意事项】SDSPAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用.摘自Takara 商品目录实验室常规试剂配制办法TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

Westernblot所需溶液的配制

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。

使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。

2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。

小片段可不加SDS。

310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。

4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。

使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。

4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。

负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。

7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。

按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

9 stacking gel buffer (4×)10 5×Sample buffer (10ml)11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液使用说明

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液使用说明
货号：T1070
规格：500ml
保存：室温保存，有效期1年。

产品说明：
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液是用于蛋白变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（SDS-PAGE）中的缓冲试剂。

本产品按常规方法配制而成，为5×浓缩液，便于储存、操作简便。

组份浓度：125mM Tris，1.25M Glycine，0.5%（W/V）SDS
使用说明：
本产品为5×浓缩液，临用前稀释成1×工作浓度：取100ml的5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，加入蒸馏水或去离子水定容至500ml混匀。

注意事项：
1.本产品为高倍浓缩液，环境温度较低时可能会有结晶析出，可加热助溶，待溶解完全后再行稀释使用；密封保存，防止污染。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴手套操作。