小鼠骨髓多染红细胞微核实验
小鼠骨髓多染红细胞微核试验(氟化钠)
若微核发生在雌雄间有明显差异时，需按照性别分别进行统计分 析。 PCE/(PCE+NCE)不低于对照值的20%
PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统 计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重 抑制；如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
小鼠骨髓多染红细胞微核实验中
3. 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分 叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为成红细 胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜 碱性约24小时，然后成为NCE,并进入外周血。 4. 在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细 胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核， 可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染 色体损伤。
?再计数200个红细胞记录pce在总红细胞pcence中的比例作为对细胞毒性的指标多染红细胞pce正染红细胞nce微粒浅兰色胞浆呈颗粒状油画淡红色胞浆呈均质状水彩画圆形或椭圆形边缘光滑染色与有核细胞的核一致紫红色大小约为红细胞的12015文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
• 本次实习采用一次染毒， 24小时后取样测定
操作步骤
24小时后 染毒 取材 制片 染色 镜检
取骨
擦净血污、剔去肌肉
பைடு நூலகம்
pH=6.4 Giemsa染色液染色10-15min
冲洗、晾干
剪去骨骺端 小 牛 pH=6.4 血 清 甲醇中固定2min 吹 干 混匀、推片 镜检、细胞计数
镜检
细胞生物实验：微核实验
实验器材
离心机，显微镜，擦镜纸，二甲 苯，香柏油，手术剪，手术镊子， 刻度离心管，1ml注射器，Giemsa 染色液，75%酒精纱布块，甲醇， 生理盐水。
实验内容和方法
1.骨髓细胞液制备：取小鼠股骨，剔
Hale Waihona Puke 净肌肉制备骨髓细胞悬液。 2.离心：1000r/min离心5分钟。 3.涂片 4.甲醇固定5分钟 5.染色：Giemsa染液中染色10分钟。 6.显微镜观察
作业与思考
1.画一个具有微核的嗜多染红细胞。 2.计算出平均微核率，并与自发微核
率（1~3‰）比较，说明微核增加的 原因。
小鼠骨髓嗜多染红细胞 微核试验
实验目的
通过对用已知诱变剂（环磷酰胺） 处理的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的 测定，初步掌握微核试验的方法和制片 技术。
实验原理
微核是染色体断裂后由遗留下来 的无着丝粒片断演化而来的次核，其 直径通常为红细胞的1/20~1/5，在骨髓 和外周血液的各类型细胞中均可见到， 但在有核细胞中，微核常难以与核叶 相鉴别，而在嗜多染红细胞中，因主 核已排除，若有微核发生则非常容易 辨认。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核自 发率很低（1~3‰），但在致变剂 的作 用下，微核发生率可明显增高，因而 微核试验是检测致畸因子的有效的手 段。
实验3-小鼠骨髓细胞微核试验-20121101
3.染毒次数及取样时间： 一般采用多次染毒方法，常用的 比较合理、方便的方法是 4 次染毒，即 每天染毒一次，连续 4 天，第 5 天（即 最 末 一 次 染 毒 后 24 小 时 ） 取 样 。 这 样 ， 仅 仅 取 样 一 次 就 能 复 盖 24~72 小 时，而且如果高峰在96小时，也不会漏 掉。（2次染毒，末一次染毒后6小时） 取样）
４.染毒剂量选择： 如有受试化学物的LD50资料，通常选 1/2 LD50作为高剂量，1/20 LD50为低剂 量，中间再安排两个剂量，并同时设立 阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组 一般用环磷酰胺（小鼠按50～100 mg/kg )，按0.1ml/10g的体积，腹腔注 射一次或二次；阴性对照使用等体积的 溶剂注射.
实 验 四 小鼠骨髓细胞微核试验
一．实验目的
1.了解遗传毒理学技术和方法 2.掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE） 微核测定方法
二. 实验原理
染色体 断裂
影响纺 缍丝
染色体 化学致突变物
无着丝点,片或环
作用于纺锤丝
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
于细胞分裂末期细胞质中
微核成因
1. 正常细胞在有丝分裂后期其染色体 逐渐从赤道向两极移动并在末期成为 两个子细胞的核心，若染色体断裂或 损伤，则它们在有丝分裂后期不能正 常向两极移动而滞留形成微核，从而 在有丝分裂的间期看到微核。
四、注意事项
1.Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的 重要保证； 2.推制良好的骨髓涂片是本试验的关 键步骤； 3.正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细 胞； 4.正确区分微核与染料颗粒。
成熟红细胞模式图
红细胞
电镜
MN NCE
Thanks!
小鼠骨髓细胞微核试验
动物骨髓细胞染色体畸变分析
目的和意义:
1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型
染色体畸变：
指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的 改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞 有丝分裂中期的染色体来发现
染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为 细胞遗传学实验
注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
流程图
处死小鼠，取胸骨
图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ）
注意事项：
低渗是本实验的关键，控制好低渗时 间，做出分散良好的染色体标本，关系到 实验结果的准确性
流程图
处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中 期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介-推荐下载
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
3.小鼠骨髓细胞微核试验
Giemsa染色时网织红细胞呈蓝灰色，称为多染红细胞；而成熟红细 胞染色呈橘红色，称为正染红细胞。
三.实验步骤 1.染毒：昆明种小鼠，环磷酰胺100mg/kg腹腔注射。 2.骨髓液制备和涂片：颈椎脱臼处死动物。解剖后取胸骨或股骨， 去除肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤出或冲洗出，滴于载玻片推片。 3.固定：晾干后甲醇固定15秒，取出晾干。 4.染色：晾干后以新鲜配制的Giemsa染液染色5-10分钟，自来水冲 洗，晾干。 5.观察计数：低倍镜选择分布均匀、染色较好的区域，油镜下观察 计数。含有微核的PCE/1000个PCE；PCE/NCE。
实验三 小鼠骨髓多染红细胞微核试验
重庆医科大学实验教学管理中心 公共卫生实验原理 3.掌握镜下辨认微核的技术
二.实验原理： 细胞分裂过程中在染色体断裂剂或纺锤体毒物作用下，细胞染色体 断裂产生不含着丝粒的断片，或者整条染色体遗失在细胞质中，形 成微核。 染色与主核一致，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，圆形或椭圆 形，一个或多个。 在多种细胞中出现。 在红细胞成熟前组后一次分裂后数小时主核排除而微核保留。
红细胞发育过程： 骨髓多能干细胞→定向干细胞→原红细胞→早幼红细胞→中幼红细 胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞 从原红细胞到晚幼红细胞需分裂3-4次。形成晚幼红细胞后即不再 分裂，在发育过程中主核排出形成网织红细胞。网织红细胞含有少 量RNA，甲酚蓝染色成蓝色丝网状。网织红细胞进一步发育，RNA消 失成为成熟红细胞。
四.结果分析与评价 1.PCE/NCE比值约为1（0.6-1.2）。比值小于0.1表明PCE生成严重 受抑制，染毒剂量过大。 2.用统计方法分析结果。 五.实验成功的关键 1.制作良好的骨髓涂片 2.优质的染色
(x)小鼠骨髓嗜多染红细胞微
结果评价
♦ 正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千
分之五以下，超过千分之五为异常 。
实验步骤（制片）
♦ (4)固定 放在甲醇液中固定5~1Omin，如
当日不染色，也需固定后保存。 ♦ (5)染色 在Giema应用液中染色10~l5min， 最后用蒸馏水冲洗。
观察计数
♦ 选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区
域，在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞 (PCE)及微核计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色， 而成熟红细胞呈桔红色。PCE中微核的嗜色性 与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。典型的微核 呈圆形，边缘光滑、整齐，其直径通常为红细 胞的1/20~1/5。偶尔也可呈椭圆形、肾形、马 蹄形及环形。PCE中微核多数为一个，也可能 有两个或两个以上的微核，此时仍按一个有微 核的PCE计算。每只动物计数200O个PCE，观察 含有微核的PCE数，微核率以千分率表示。
实验原理
♦ 骨髓中PCE数量充足，微核容易辨认，
而且微核自发率低。由于这些优点，骨 髓的PCE细胞成为骨髓微核试验的首选 细胞群。故一般检查嗜多染红细胞中微 核的多少来鉴别是否异常;
试剂和材料
♦ 主要试剂 ♦ 胎牛血清 ♦ 材料： ♦ 小平皿、滤纸、载玻
片、离心机、显微镜 ♦ 成年小鼠，体重1822克。
实验步骤（制片）
♦ (2)离心 以10OOrpm离心5min，用毛细吸
管吸去上清液。如沉淀物较多，可留下 少许血清，否则应吸去全部上清液。最 后，用毛细吸管尖端把沉淀物混匀。 ♦ (3)涂片 吸取一小滴混悬液滴于玻片的 一端，按常规血涂片法涂片，约2·3cm长 度，在空气中晾干(若立即染色，可在酒 精灯上稍加烘烤)。
实验步骤
♦灌药 ♦制片
实验步骤（灌药）
实验四.小鼠骨髓细胞微核试验
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。
主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。
3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。
3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。
3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。
4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。
4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。
4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。
置37℃恒温箱中保温48h。
保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。
实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。
4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
小鼠骨髓细胞微核试验
（三）固定、染色 推片晾干 加6~10滴染液盖满玻片30秒 加水10~15滴混匀 染色6~8分钟 洗去 染液
（五）观察结果 1.先在低倍镜下选择分布均匀，染色的区域 2.在油镜下观察计数。
3.计数 300~600个PCE中含微核的 PCE数， 并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 （PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞呈桔黄色）
3.实验试剂：甲苯、环磷酰胺、小牛血清、 生理盐水、快速染液等。
四、操作步骤
（一）试验动物及处理
1.动物选择：小鼠，体重18～20g，7～12周龄。每 组小鼠数量4只。
2.染毒途径：经口染毒。 3.染毒次数：每天染毒一次，连续4天，第5天取样。 4.剂量选择：1/2 LD50为最高剂量。甲苯灌胃 0.06ml/20g、0.03ml/20g、0.02ml/20g。 5.对照组：阳性对照组环磷酸胺（60mg/kg）腹腔注 射一次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
六、注意事项
该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片 及优质的染色。
（微核多呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核 质一致，呈紫红色或蓝紫色。）
五、结果分析与评价
微核率以千分率表示。每只动物为一观察单 位。 正常的PCE／NCE比值约为1（正常范围为 0.6～1.2）。 阳性对照组微核发生率一般大于千分之五， 且与阴性对照组比较有统计学意义。 阳性结果：受试物至少一个剂量组与对照组 比较有统计学意义，且有剂量反应关系。
小鼠骨髓Hale Waihona Puke 胞微核试验公共卫生学院 冯昶
一、目 的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞 （PCE）微核测定方法
二、原 理
1.微核的形态： 2.观察、检测对象： 3.微核试验的意义：
小鼠骨髓微核试验
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
正常的PCE/NCE比值约为1（正常范围0.6 ~
1.2）；PCE/NCE＜0.1，
阴性对照组和阳性对照组的微核发生率 多种统计学方法（Poinsson分布、二项分布、
x2检验等）均有人应用
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
注意：本实验的关键步骤是制作良好的骨 髓涂片及优质的染色。
姆萨染色呈灰蓝色；成熟红细胞（NCE）的核糖体已
消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充 足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓 中嗜多染红细胞成为微核试验的首选剂
器材： 手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、 干净纱布、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻 璃染色缸、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微 镜、细胞计数器 试剂：甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血 清、生理盐水、Giemsa贮备液、磷酸盐缓冲液（ pH6.8） 阳性对照物：环磷酰胺或丝裂霉素C
正染红细胞 嗜多染红细胞及微核
首都医科大学
毒理学基础
正染红细胞
嗜多染红细胞及微核
首都医科大学
毒理学基础
首都医科大学
毒理学基础
首都医科大学
毒理学基础
染色太浅
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千 分率（‰）表示 若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上 微核，仍按一个有微核细胞计数
毒理学基础
实习二 小鼠骨髓细胞微核试验
卫生毒理与卫生化学系
2013.10.22
首都医科大学
毒理学基础
（一）目的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微 核测定方法。
实验五 小鼠骨髓细胞微核试验
四、染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 份)染色10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 臵晾片架上晾干。
南京晓庄学院
上一张
下一张
开 始
结 束
3
经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
南京晓庄学院
上一张
下一张
开 始
结 束
3
经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
4. 实验步骤
二、骨髓液的制备和涂片
试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖 板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用小型弯 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头 的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内，将骨 髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均 匀，以1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 留下约0.5ml
南京晓庄学院
上一张
下一张
开 始
结 束
3
经口急性毒性 实验
实验目的 实验内容 实验材料 实验步骤 实验结果 结果分析
4. 实验步骤
求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。 考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒 的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天 染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样 一次就能覆盖24～72h高峰，如果高峰延迟到 96h也不会漏掉。 4.剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶 解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情 况下，应设3～5个或更多剂量组，剂量覆盖的 范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性 对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰 胺(50-100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注 射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
小鼠骨髓细胞微核试验
四、
操作步骤
1． 动物一般选用 7~12 周的、体重 20~30g 的小鼠，也可选用体重 150~200g 的大鼠。 每个剂量组至少用两种性别的动物各 5 只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加， 每个采样时间至少有 8 性质 （尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ， 确定溶剂。 一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的 1/2~1/30LD50 范围内选择 3~4 个剂量组。 也可采用急性毒性试验中出现中毒 而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入 1~2 个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理 盐水溶液一次腹腔注射 30~50mg/kg，或以环磷酰胺水溶液 80~120mg/kg，经口染毒两次， 间隔 24h。 3．染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮 下或肌肉注射等染毒途径。 4．染毒方法一般采用 2 次染毒方法，两次间隔 24h。 5．制片 （1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物 6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股 骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。用配有 6 号针头 1ml 注射器 吸取小牛血清约 0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。 （2） 涂片将玻片上的冲洗物调匀后， 推片若干张。 迅速干燥， 可在酒精灯上短时烘烤。 （3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定 5~10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应 固定后保存。 （4）染色固定好的涂片用 1:10 的吉姆萨-磷酸缓冲液（pH6.4）染色 15~30min。用蒸馏 水冲洗，干燥，待检。 为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入 0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲 液内，染色 2~3min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 1~2min。晾干后在荧光显微镜下 观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应 避光，以防荧光减弱或消失。 （5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明 6min，取出后趁湿 滴上适量中性树脂胶， 盖上盖玻片， 平置。 待干后却可收入盒内备检。 若在短时内进行观察， 涂片不需制成涂片。 （6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再 以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好， 作为判断制片优劣的标准。 嗜多染红细胞 （PCE） 呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。 每只动物需计数 1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数， 列入表实 6-1。 在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并 以千分率表示。 微核率列入表实 6-2。 另外， 在计数 PCE 时， 计数见到的 NCE 数， 求出 PCE/NCE 的比值。 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数× 100% 表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计 性别 空白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
小鼠骨髓细胞微核试验
叶及核的突起难以鉴别） 2.胞内含核糖体，染色后成灰蓝色（区别于成熟红
细胞，其无核糖体、染色呈淡橘红色） 3.骨髓中PCE数量充足，满足实验计数的要求
三、意义及应用
检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体 完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学 终点。
试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时， 可认为受试物为具有遗传毒性。
骨髓微核观察的步骤
取胸骨
擦净血污，剔去肌肉
剪去骨骺端
小牛血清
混匀、推片
晾干
Gie 骨髓液制备：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨 髓液。
涂片及染色：涂片均匀，防止细胞重叠 染色层次分明（染液新鲜配制、pH、染色时间）
观察与计数
五、操作步骤
骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀
五、操作步骤
染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴，
迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴， 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检
五、操作步骤
观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核
五、操作步骤
观察
镜下有3种细胞：
PCE:
灰蓝色
NCE： 橘黄色
有核细胞：蓝紫色
微核：
蓝紫色、 圆形、 边缘规则
五、操作步骤
计数及结果分析
1. 总共200个细胞中，计数PCE与NCE的比值 正常范围 0.6-1.2 PCE/NCE评价细胞毒性的指标 P值具有统计学意义：受试化学物剂量过大，PCE形成受
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小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
检验机构全称
检验报告
样品受理编号：第页/共页
样品名称接样日期
检验项目小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验检验完成日期
一、材料和动物
1．受试样品：名称及批号、剂型、颜色、嗅味、液体比重等。
2．阳性对照物：名称、来源和批号。
3．动物：品种、来源、等级、合格证号、动物数、性别、体重范围，饲料及饲养环境条件。
4. 其它可能影响试验结果的材料及其有关情况。
二、方法：
1. 检测依据 (写明所依据的资料及所在的条目)。
2．简述动物分组、剂量设计、受试物配制、染毒方法、取材时间、制片、观察、统计方法和阴性、阳性对照组的处理。
3．检测依据中未包括或需要特殊说明可能影响检测结果的问题。
三、试验结果
文字叙述染毒后动物中毒表现。
将试验结果列表6-61，并说明统计学检验结果。
表6-61 小鼠骨髓细胞微核试验结果
分组
剂量
（mg/kg）
动物数
（只）
受检PCE数含微核PCE数
微核细胞率
（‰）
PCE/NCE
试验组
阴性对照组
阳性对照组
注：微核细胞率（‰）和PCE/NCE均以小鼠为单位统计，表示为均值±标准差。
四、结论：
受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞有无致微核作用。
法定代表人(或授权的技术负责人) (签字) 检验机构
盖章
最终审核日期年月日
( ) 量认（）字（）号。
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小鼠骨髓多染红细胞微核实验
目的和意义
微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。
通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。
原理
正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。
如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。
由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。
进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。
器材与试剂
1、器材
载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。
2、试剂
小牛血清；
甲醇；
吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。
放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。
取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。
吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）
阳性对照物：环磷酰胺。
操作步骤
一、试验动物及处理
1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。
小鼠体重在18~20g，7~12w。
2、染毒途径：采用腹腔注射给药。
3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。
4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。
二、骨髓液的制备和涂片
脱颈椎处死小鼠，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，横向切断胸骨，暴露骨髓腔挤出骨髓，小心地涂布于载玻片一端的胎牛血清液滴里，混匀涂片。
三、固定
骨髓涂片于空气中晾干后，放入甲醇中固定15分钟，取出自然晾干。
四、染色
固定晾干的玻片在吉姆萨染色液中染色10 15分钟，然后冲洗掉玻片上的染液，自然晾干。
五、镜检
先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
成熟的红细胞呈桔黄色，而嗜多染红细胞呈灰蓝色。
微核大多数呈圆形或椭圆形、单个或多个、边缘光滑整齐，染色与核一致，呈紫红色或蓝紫色。
一个细胞内可出现一个或多个微核。
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE 与NCE的比值。
六、结果分析与评价
微核率以千分率表示。
每只动物为一观察单位，每组动物计算微核PCE均值的。
正常的PCE/NCE约为1（0.6~1.2），如比值<0.1，表示PCE形成受到严重抑制，受试化学物的剂量过大，试验结果不可靠。