Takara说明书
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书Takara反转录试剂盒是一种用于研究RNA分子的试剂盒。
该试剂盒可以用于DNA的反转录，将RNA转录成DNA，并进行后续的PCR扩增。
反转录试剂盒在生命科学领域中起着非常重要的作用，因此在使用过程中需仔细阅读说明书并按照说明书进行操作。
一、试剂盒组成Takara反转录试剂盒主要包含以下拉玛：1.反转录酶：外源的M-MLV反转录酶，具有高度的反转录活性和优异的扩增效率等优良特性。
2.反转录缓冲液：针对反转录酶的酶切优化反转录缓冲液。
3.引物：随机9mers引物，适用于多种RNA逆转录的应用。
4.对照RNA：In Vitro转录的任意序列的RNA，用于反转录和后续PCR扩增反应的质控。
二、试剂盒使用方法1. RNA提取：在使用Takara反转录试剂盒之前，需要从样品中提取RNA。
2. 反转录反应：将RNA测序专用随机引物、针对反转录酶的反转录缓冲液、反转录酶和RNA样品混合，进行逆转录反应。
3. PCR扩增：反转录完成后，可以利用PCR扩增技术对转录所得DNA进行扩增，完成DNA序列的检测和分析。
三、试剂盒注意事项1. 避免多次冻融。
为保证试剂的稳定性，反转录试剂盒必须储存于-20℃及以下的冰箱中，避免多次冻融。
2. 操作时需佩戴手套。
操作时需佩戴手套，尽量避免手汗或皮脂的污染，影响试剂盒的效率和准确性。
3. 注意反转录缓冲液的稀释量。
反转录缓冲液的稀释量会影响反转录效果，因此需要按照说明书进行操作，精准稀释。
4. 注意反转录酶的用量。
不同反转录酶的最优用量不同，需要根据实验需要按照说明书或文献进行调整。
5. 确认对照RNA引物的扩增效果。
在进行PCR扩增前，需要先进行对照RNA引物的扩增，以确认反转录反应的正确性，避免因为反应偏差而引起的实验结果的偏差。
4. 根据实验需要进行调整。
反转录试剂盒虽然具有大量的优良特性，但是实验环境和实验条件的不同，会对反转录试剂盒的效果产生较大的影响，因此需要根据实验需要进行调整。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
照说明书的要求进行。 ② DNA 中含有乙醇。在 Rinse B 洗净时，离心速度和时间应严格遵循说明书要求进行。
Q5. 能否使用本试剂盒提取酵母菌中的基因组 DNA？ A5. 不能。因为酵母菌属于真核微生物，其细胞壁的化学组成和结构与细菌不同，因此 Lysozyme 不
TaKaRa Code：DV810A
MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0 （50 次量）
说明书
宝生物工程(大连)有限公司
内容
●制品说明 ●制品内容 ●运输温度 ●保存温度 ●实验前的准备 ●操作方法 ●使用例 ●注意事项 ●Q&A
22 ml
Solution C
35 ml
DB Buffer
25 ml
Rinse A
28 ml
Rinse B*3
24 ml
Elution Buffer
4 ml
*1 RNase A1 为混浊溶液。 *2 若出现沉淀，请于 65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 *3 首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇。
11. 弃 Filter Cup，在滤液中加入 450 μl 的 DB Buffer， 混合均匀。
12. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。
-2-
图 1. 操作流程简图
13. 将上述操作 11 的混合液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 14. 将 500 μl 的 Rinse A 加入至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
TaKaRa TP600型 梯度PCR仪使用说明书
TP600型PCR仪使用说明目 录一．外观及功能介绍----------------------------------------------------------------------------------------2二．性能一览表----------------------------------------------------------------------------------------------3三．操作方法------------------------------------------------------------------------------------------------3 1．概述------------------------------------------------------------------------------------------------3 2．使用现有程序进行PCR反应-----------------------------------------------------------------4 3．建立新程序---------------------------------------------------------------------------------------7 4．修改现有程序------------------------------------------------------------------------------------9 5．注册新用户---------------------------------------------------------------------------------------9 6．应用扩展模式-----------------------------------------------------------------------------------10 7．工具栏的使用-----------------------------------------------------------------------------------12一． 外观及功能介绍TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600TP600型PCR 仪是T aKaRa 公司推出的多功能，高性能的梯度PCR 仪。
TaKaRa 提取RNA说明书
T a K a R a提取R N A说
明书
-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
TaKaRa Code TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extration Kit 说明书
一、制品说明
本试剂盒是小量提取植物组织Total RNA 的试剂盒。
试剂盒采用了独特的裂解系统，可以对各种简单的植物材料（叶片、茎、幼苗等）富含多糖多酚的植物组织材料（果实、种子）、真菌等进行RNA的提取，适用范围广。
按照标准流程使用本试剂盒可以有效提取分子量大于200nt的RNA，也可以按照可选步骤提取得到包含Small RNA（＜200nt）的Total RNA。
试剂盒中包含了RNA提取所需的全部是局，无需额外购买其他试剂。
本试剂盒具有高效、快速、方便的特点，组织或自爆裂解后，提取操作仅需要30min 便可完成操作。
提取过程中无需苯酚氯仿抽提等步骤。
利用该试剂盒提取的RNA纯度高，基本不含蛋白质及及基因组DNA污染。
本试剂盒可以从50mg—100mg植物组织中纯化得到多至数十微克的高纯度RNA。
提取得到的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二、制品内容（50次量）
本试剂盒分两部分|Part 1和Part 2。
（1）Part 1 （-20℃保存）
2。
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。
本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。
2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。
3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。
4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。
5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。
三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。
2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。
3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。
反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。
4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。
5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。
四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。
常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。
根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。
五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。
2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。
3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。
TaKaRa TP600型 梯度PCR仪使用说明书
TP600型PCR仪使用说明目 录一．外观及功能介绍----------------------------------------------------------------------------------------2二．性能一览表----------------------------------------------------------------------------------------------3三．操作方法------------------------------------------------------------------------------------------------3 1．概述------------------------------------------------------------------------------------------------3 2．使用现有程序进行PCR反应-----------------------------------------------------------------4 3．建立新程序---------------------------------------------------------------------------------------7 4．修改现有程序------------------------------------------------------------------------------------9 5．注册新用户---------------------------------------------------------------------------------------9 6．应用扩展模式-----------------------------------------------------------------------------------10 7．工具栏的使用-----------------------------------------------------------------------------------12一． 外观及功能介绍TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600TP600型PCR 仪是T aKaRa 公司推出的多功能，高性能的梯度PCR 仪。
takara 胶回收试剂盒说明书
操作流程1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。
注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3. 切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：凝胶浓度Buffer GM使用量1.0％3个凝胶体积量1.0％～1.5％4个凝胶体积量1.5％～2.0％5个凝胶体积量6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。
此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。
7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。
TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书
加入 Extraction Solution 2 振荡仪振荡 5 秒，轻微离心
加入 Extraction Solution 3 振荡仪振荡 5 秒，轻微离心
50℃温浴 15 分钟
上层水相移至新的 Microtube 中 加入异丙醇混匀后，12,000 rpm 4℃离心 10 分钟
-1-
8. 轻微离心 2 秒钟以内，于 50℃温浴 15 分钟。 注：长时间离心 Extraction Solution 3 将会分层， 务必控制在 2 秒钟以内。
9. 12,000 rpm 4℃离心 15 分钟。 10. 取上层水相移至新的 1.5 ml Microtube 中，上层水
相约 400 μl。注意尽量不要混入水相以外的物质。 11. 添加等量的异丙醇，轻柔混匀。
除去上清，加入 1 ml 70％乙醇清洗沉淀 12,000 rpm 4℃离心 3 分钟
●实验例
除去上清，沉淀干燥后用 TE Buffer 溶解
实验例 1：从植物组织中提取基因组 DNA
将拟南芥的幼芽、西红柿的幼芽和菠菜叶用剪刀剪至 3 mm 以下角形状，分别称取 20 mg 和 50 mg 放入
1.5 ml Microtube 中，于-20℃冻结后按“操作方法”进行基因组 DNA 的提取，基因组 DNA 使用 20 μl TE
淀。 注：沉淀过度干燥将导致难以溶解，请注意。
注 1. 回收的基因组 DNA 溶液可直接作为 PCR 反应的 模板或直接进行限制酶切断等反应。 使用 20 μl TE Buffer 溶解基因组 DNA 时，PCR 反应液（25 μl 反应体系）或限制酶酶切反应液（20 μl 反应体系）中添加的 DNA 溶液在 0.5～2 μl 之 间为好。
TaKaRa 提取RNA说明书
TaKaRa Code N0.9769 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extration Kit 说明书
一、制品说明
本试剂盒是小量提取植物组织Total RNA 的试剂盒。
试剂盒采用了独特的裂解系统，可以对各种简单的植物材料（叶片、茎、幼苗等）富含多糖多酚的植物组织材料（果实、种子）、真菌等进行RNA的提取，适用范围广。
按照标准流程使用本试剂盒可以有效提取分子量大于200nt的RNA，也可以按照可选步骤提取得到包含Small RNA（＜200nt）的Total RNA。
试剂盒中包含了RNA提取所需的全部是局，无需额外购买其他试剂。
本试剂盒具有高效、快速、方便的特点，组织或自爆裂解后，提取操作仅需要30min 便可完成操作。
提取过程中无需苯酚氯仿抽提等步骤。
利用该试剂盒提取的RNA纯度高，基本不含蛋白质及及基因组DNA污染。
本试剂盒可以从50mg—100mg植物组织中纯化得到多至数十微克的高纯度RNA。
提取得到的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
二、制品内容（50次量）
本试剂盒分两部分|Part 1和Part 2。
TAKARA---RR036A说明书
Code No. RR036A 研究用PrimeScript™RT Master Mix(Perfect Real Time)说明书v201605Da目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 1 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 2 ●实验例 5 ●附录 5 ●关联产品7●制品说明本制品是2 Step Real Time RT-PCR用的理想反转录反应试剂。
5×PrimeScript RT Master Mix中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。
使用具有较强延伸能力的PrimeScript RTase，与制品PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code No. RR037Q/A/B）相同，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用模板cDNA。
本制品合成的cDNA可以用于SYBR® Green qPCR分析法和探针分析法，可以根据实验目的与SYBR Premix Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR820Q/A/B）、SYBR Fast qPCR Mix（Code No. RR430S/A/B）和Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）等定量试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。
注意：Takara Bio使用SYBR Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。
●制品内容（10 μl反应×200次）1. 5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）*1 400 μl2. RNase Free dH2O 1 ml×2支3. EASY Dilution（for Real Time PCR）*2 1 ml*1：含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer（含有Mg2+）。
Takara 感受态制备试剂盒说明书
TaKaRa Code：D406Competent Cell Preparation Kit次（200量）宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1●制品内容 1●制品保存 1●使用注意 1●感受态细胞的制备方法 1●感受态细胞的DNA转化 2●实验例 2●相关试剂及培养基的制备方法 3■Ampicillin 3■IPTG 3■X-Gal 3■LB培养基 3■LB/Amp培养基 3■SOB培养基 3■SOC培养基 4■φb×broth 4■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基 4●制品说明大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。
在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。
实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。
TaKaRa Competent Cell Preparation Kit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coli DH5α、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mut S等，转化效率均可以达到1×106 cfu/μg pUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。
●制品内容（200次量）Solution A 20 mlSolution B 20 ml●制品保存：4℃保存。
●使用注意1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。
Takara GT-T551 淋巴细胞、DC 细胞、NK 细胞培养基说明书
V2016.1
TAKARA BIO INC. 沃卡威（北京）生物技术有限公司
TaKaRa Code：GT-T551
淋巴细胞、DC 细胞、
NK 细胞培养基
产品描述
■ TAKARA 淋巴细胞、DC 细胞及NK 细胞培养基GT-T551 产品特点：
日本原装进口无血清培养基，适用于人体淋巴细胞及DC 细胞培养
支持淋巴细胞的高密度细胞培养，已经加入人血白蛋白组分
ex-vivo 级别，已经在日本水町综合医院，New City 大崎医院及多家大型医院临床应用 配制用水符合国家药监局《人体细胞治疗研究和制剂质量控制指导原则》中注射用水标准
■ 日本TAKARA 淋巴细胞、DC 细胞及NK 细胞培养基GT-T551 H3产品特点： GT-T551 升级版培养基。
采用全新的缓冲系统。
可用于无血浆培养，CD3+CD56+比例高。
如果培养时添加病人自体血浆，效果更为显著。
GT-T551 H3
淋巴细胞、DC 细胞、NK 细胞培养基 1000 ml GT-T551 H2
淋巴细胞、DC 细胞、NK 细胞培养基 1000 ml GT-T551 淋巴细胞培养基 1000 ml
◆保存: 4℃,避免冻结产品
◆产品形态: 透明液体
说明书。
Takara 感受态制备试剂盒说明书
TaKaRa Code：D406Competent Cell Preparation Kit次（200量）宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 页 码●制品说明 1●制品内容 1●制品保存 1●使用注意 1●感受态细胞的制备方法 1●感受态细胞的DNA转化 2●实验例 2●相关试剂及培养基的制备方法 3■Ampicillin 3■IPTG 3■X-Gal 3■LB培养基 3■LB/Amp培养基 3■SOB培养基 3■SOC培养基 4■φb×broth 4■LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基 4●制品说明大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（Competent Cell）。
在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。
实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温）；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。
TaKaRa Competent Cell Preparation Kit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coli DH5α、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mut S等，转化效率均可以达到1×106 cfu/μg pUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。
●制品内容（200次量）Solution A 20 mlSolution B 20 ml●制品保存：4℃保存。
●使用注意1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
1% Agarose 凝胶电泳图 M1 ： λ-Hind III digest DNA Marker
1 ： 纯化的基因组 DNA 2 ： PCR 扩增片段（约 1,500 bp） M2 ： DL2,000 DNA Marker
图 2.基因组 DNA 及其 PCR 扩增结果电泳图 -3-
注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。 15. 重复操作步骤 14，然后从负压装置上取下 Spin Column，将其安置于试剂盒中的 Collection Tube
上。 16. 12, 000 rpm 离心 1 分钟。 17. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 60 μl 的灭菌
Q1. 基因组 DNA 的收率较低或无基因组 DNA，为什么？ A1. 一般正常情况下，1～4 ml 的过夜培养大肠杆菌中，可以提取约 3 μg 的基因组 DNA。基因组 DNA
收量较低时，可以从以下几个方面考虑： ① DNA 未充分释放。保证在 SP Buffer 中充分悬浮菌体，注意不要残留菌块；加入 Solution A
否则将阻碍 DNA 结合到 DNA 制备膜上。 5. 部分试剂中含刺激性化合物，在步骤 7 以后的操作中请戴上乳胶手套和眼镜，并应尽量在通风橱中
进行。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。 6. 基因组 DNA 需长期保存时，建议在 Elution Buffer 中保存。
●Q&A
11. 弃 Filter Cup，在滤液中加入 450 μl 的 DB Buffer， 混合均匀。
12. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书关键信息项：1、试剂盒名称：Takara 反转录试剂盒2、适用样本类型：＿___________________________3、反应体系：＿___________________________4、反应条件：＿___________________________5、储存条件：＿___________________________6、有效期：＿___________________________1、产品简介11 Takara 反转录试剂盒是一种用于将 RNA 反转录为 cDNA 的高效、可靠的工具。
111 本试剂盒经过精心设计和优化，能够提供高质量的反转录产物，适用于各种下游分子生物学实验。
2、试剂盒组成21 反转录酶211 具有高活性和热稳定性，确保反转录反应的高效进行。
22 反转录缓冲液221 包含各种必要的成分，为反转录反应提供适宜的环境。
23 RNA 酶抑制剂231 有效抑制 RNA 酶的活性，防止 RNA 降解。
24 随机引物或 oligo(dT)引物241 可根据实验需求选择合适的引物进行反转录。
25 dNTP 混合物251 提供四种脱氧核糖核苷酸，用于 cDNA 合成。
3、适用样本类型31 总 RNA311 包括从细胞、组织、血液等样本中提取的总 RNA。
32 mRNA321 经过纯化或富集的 mRNA 样本。
4、反应体系41 建议的反应体系如下：411 RNA 模板：X μL（根据 RNA 浓度和实验需求确定）412 随机引物或 oligo(dT)引物：Y μL413 dNTP 混合物：Z μL414 反转录缓冲液：A μL415 RNA 酶抑制剂：B μL416 反转录酶：C μL417 无 RNase 水：补充至总体积D μL5、反应条件51 反转录反应的温度和时间可根据引物类型和RNA 质量进行调整。
511 使用随机引物时，反应条件通常为：25°C 孵育 10 分钟，然后42°C 孵育 30 60 分钟。
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
Takara phanta说明书
Takara phanta说明书Takara phanta蓝牙音响说明书：一、注意事项1、为了使用者正确使用播放器，确保播放器性能良好，请认真阅读并遵守：2、切勿严重撞击主机。
3、切勿接触苯、稀释剂等化学药品。
4、请不要靠近强磁场、电场。
5、请避开直射光线或发热器具。
6、切勿自行拆卸、修理、改造。
7、骑车、驾驶汽车及摩托车时，请勿使用播放器及耳机，以免造成危险。
8、切勿以较大音量收听，以免对听力造成不良影响。
9、废弃包装、电池、旧电子产品，请分类妥善处理。
二、功能特点[蓝牙音频] Bluetooth 3、0+EDR，最大接收距离10米。
[蓝牙通话] 语音清晰、无回声。
[MP3 播放] 直接播放TF卡内存放的MP3文件。
[FM收音机] FM数字立体声收音机，电台记忆播放。
[音频输入] 立体声音频输入接口，轻松连接电脑、数码音乐播放器、手机等音源设备。
[断点记忆] 自动记忆上次退出时的曲目，音量大小。
[内置电池] 内置可充电锂电池，环保，节能，实用。
[USB读卡器] 连接电脑，可拷贝或删除TF卡中的歌曲。
[USB声卡] 连接电脑，播放电脑音频文件，可控制电脑上下曲、音量大小。
三、播放音乐操作本机开机时自动检测识别外接设备，开机后进入蓝牙/FM 模式，插入TF卡自动识别播放，后者优先原则，也可自行切换播放模式。
插入音频信号线不自动切换，通过[O/PLAY]键切换到AUX模式下播放，详细功能操作请阅读第四项“产品的按键、插孔功能定义”。
四、产品的按键、插孔功能定义(以实物为准)1、[ON/OFF]：电源开关。
ON为开，OFF为关。
2、[O/PLAY]：播放/暂停/接听电话/挂断电话/模式转换/全自动搜台。
短按：TF、AUX和蓝牙模式为播放/暂停，FM模式为全自动搜台。
来电时短按接电话，通话时短按挂机。
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takara分子伴侣说明书
takara分⼦伴侣说明书Cat. # 3340 For Research Use Chaperone Plasmid SetProduct Manualv201405Table of ContentsI. Description (3)II. Components (3)III. Storage (5)IV. Protocol (5)V. FAQs (6)VI. References (8)VII. Related Products (9)Safety PrecautionsBecause the araB promoter and araC gene derived from Salmonella typhimurium are present on the Chaperone Plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, and pTf16, please follow all relevant guidelines for experiments using recombinant DNA as indicted by your organization when using this prod-uct.I．DescriptionLarge-scale expression of recombinant proteins is essential for structural and func-tional analyses of proteins. A variety of protein expression systems have been devel-oped to produce high levels of protein. Escherichia coli is commonly used as a hostfor protein expression, since it is a simple system that can be used to express a widevariety of proteins. However, expression of protein in E. coli often results in variousproblems, such as the formation of inclusion bodies and protease degradation of theprotein. These frequently encountered issues often are a result of improper folding ofthe expressed proteins.Molecular chaperones are involved in protein folding, and numerous studies havebeen conducted to elucidate the mechanisms of in vivo protein folding. Takara's Chap-erone Plasmid Set consists of five different types of chaperone plasmids developed byHSP Research Institute, Inc. The plasmids are designed to enable efficient expressionof multiple molecular chaperones known to work cooperatively in the protein foldingprocess. It has been reported that coexpression of a target protein with one of thesechaperone plasmids increases recovery of expressed proteins in the soluble fraction.Such proteins often form inclusion bodies using conventional methods (Figure 1). II．Components1．Plasmid pG-KJE8 : 10 ng/µl 100 µl2．Plasmid pGro7 : 10 ng/µl 100 µl3．Plasmid pKJE7 : 10 ng/µl 100 µl4．Plasmid pG-Tf2 : 10 ng/µl 100 µl5．Plasmid pTf16 : 10 ng/µl 100 µlNo.Plasmid Chaperone Promoter Inducer Resistant Marker References1pG-KJE8d n a K-d n a J-grpE araB L-Arabinose Cm2, 3groES-groEL Pzt-1Tetracycline2pGro7groES-groEL araB L-Arabinose Cm23pKJE7d n a K-d n a J-grpE araB L-Arabinose Cm24pG-Tf2groES-groEL-tig Pzt-1Tetracycline Cm35pTf16tig araB L-Arabinose Cm3These chaperone plasmids carry an origin of replication derived from pACYC and a chloramphenicol resistance gene (Cm r). This allows the plasmids to be used withE. coli expression systems that utilize ColE1-type plasmids containing the ampicillin resistance gene as a marker. The chaperone genes are downstream of either the araBor Pzt-1 (tet) promoter. Thus, expression of target proteins and chaperones can be in-duced individually if the target gene is placed under the control of another promoter (e.g., lac). These plasmids also contain either araC or tetR for each promoter. Note that this system cannot be used in combination with chloramphenicol-resistant E. coli host strains or expression plasmids that carry the chloramphenicol-resistance gene. For ex-ample, E. coli BL21 (DE3), which is often used with pET systems can be used as a host strain, but E. coli BL21 (DE3) pLysS or BL21 (DE3) pLysE which contain either the pLysS or pLysE plasmids containing the pACYC replication origin and the Cm r gene, cannot be used with this system. Other applicable hosts include E. coli JM109. ArrayFig. 1 Possible model for chaperone - assisted protein folding in E. coli (Reference 1). III．Storage－20℃IV．ProtocolThe optimal chaperone plasmid and culture conditions (e.g., medium, culture temperature, aeration conditions, time of induction, inducer concentration, and induction period) vary depending upon the target protein. An example is provided below. Optimal conditions should be determined independently for each target protein.1．Construction of a System for CoexpressionAn effective method for constructing a system for coexpression of target proteins and chaperones involves two steps: transformation of E. coli with a chaperone plas-mid followed by transformation with an expression plasmid for the target protein. One-step methods, i.e. simultaneous transformation with a chaperone plasmidand an expression plasmid for a target protein, and two-step methods involving transformation with an expression plasmid followed by transformation with a chaperone plasmid are not recommended, as they are known to result in very low transformation efficiency.(1) Construct an expression plasmid for a target protein to be expressed in E. coli.(2) Prepare competent cells of an E. coli expression host using a standard method. (Commercially available competent cells may be used instead.)(3) Transform the competent cells prepared in (2) with one of the chaperone plas-mids contained in this set (use ~1 µl of plasmid for each transformation), and select the transformants from plates containing 20 µg/ml chloramphenicol.(4) Culture the transformants with the chaperone plasmid in liquid medium con-taining 20 µg/ml chloramphenicol and prepare the competent cells using a standard method.(5) Retransform the cells prepared in (4) with the expression plasmid for the target protein, and select transformants from plates containing 20 µg/ml chloram-phenicol and the appropriate selection reagent for the expression plasmid. 2．Coexpression ExperimentThe experiment shown below is an example of a coexpression experiment that uses a pUC plasmid carrying the ampicillin resistance marker and the target gene downstream of the lac promoter, and a chaperone plasmid from this set.(1) To perform coexpression, inoculate the transformants into L medium contain-ing 20 µg/ml chloramphenicol and 50 µg/ml ampicillin for plasmid selectionand 0.5 - 4 mg/ml L-arabinose and/or 1 - 10 ng/ml tetracycline＊ for induc-tion of chaperone expression. Incubate at 30 - 37℃. Use both L-arabinose and tetracycline with pG-KJE8, L-arabinose only with pGro7, pKJE7, or pTf16, and tetracycline only with pG-Tf2.＊: Use 0.5 mg/ml of L-arabinose and/or 5 ng/ml of tetracycline at first.Low concentrations of tetracycline do not significantly affect thegrowth of E. coli.(2) When the OD600 of the culture reaches 0.4 - 0.6, add IPTG to a final concentra-tion of 0.1 - 1 mM, and culture at 30 - 37℃ for 1 - 4 h.(3) After culturing, determine the amount of soluble target protein expressed by SDS-PAGE and/or activity assay, Additionally, test various culture conditions (e.g., medium type, culture temperature, aeration conditions, time of induction, inducer concentration, and induction period) to determine optimal conditions. V．FAQQ1. What size of chaperone proteins is expressed in this system?A1. It is reported that the size of the expressed chaperone proteins is:GroEL (around 60 kDa)GroES (around 10 kDa)DnaK (around 70 kDa)DnaJ (around 40 kDa)Tf (around 56 kDa)GrpE (around 22 kDa)Please note that you might have a slightly different results in an actual SDS-PAGE analysis. For example, the GrpE band is usually identified above the 29 kDa marker.Fig. 2 Chaperone plasmidsQ2. How should the target protein be purified?A2. We recommend Ni affinity purification using His-Tag.If the target protein is purified using a GST-Tag, there is a possibility that the puri-fied target protein may contain some residual chaperone proteins, due to non-specific absorption with the glutathione resin. This can be detected as bands by SDS-PAGE.If this occurs, it is reported that each of the following steps can be used to im-prove purity:Separate by ion-exchange resin [Proc. Natl. Acd. Sci. USA (1995), 92, 1048]Separate by ATP-Agarose substrate [J. Biol. Chem. (1984), 259, 8820]Wash the glutathione resin bound with the GST-Tag fused target proteinwith a buffer including 3 mM Mg-ATP.Wash the glutathione resin bound with the GST-Tag fused target proteinwith a buffer including 10 mM Mg-ATP and 5 mg/ml casein and incubateat room temperature for 20 - 40 min.VI．ReferencesReviews1. Thomas, J. G., et al. (1997) Molecular Chaperones, Folding Catalysts, and theRecovery of Active Recombinant Proteins from E. coli. Appl. Biochem. Biotech66:197-238Expression of soluble recombinant proteins through coexpression with chaperones2. Nishihara, K., et al. (1998) Chaperone Coexpression Plasmids:Differential and Synergistic Roles of DnaK-DnaJ-GroE and GroEL-GroES in As-sisting Folding of an Allergen of Japanese Cedar Pollen, Cryj2, in Eschericia coli.Appl. Environ. Microbiol. 64:1694-16993. Nishihara, K., et al. (2000) Overexpression of Trigger Factor Prevents Aggrega-tion of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 66:884-889VII．Related ProductspCold? I DNA (Cat. #3361)*2pCold? II DNA (Cat. #3362)pCold? III DNA (Cat. #3363)pCold? IV DNA (Cat. #3364)pCold? Vector Set (Cat. #3360)*2pCold? TF DNA (Cat. #3365)*2Chaperone Competent Cells BL21 Set (Cat. #9120)*2Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21 (Cat. #9121)*2Chaperone Competent Cell pGro7/BL21 (Cat. #9122)*2Chaperone Competent Cell pKJE7/BL21 (Cat. #9123)*2Chaperone Competent Cell pG-Tf2/BL21 (Cat. #9124)*2Chaperone Competent Cell pTf16/BL21 (Cat. #9125)*2TaKaRa Competent Cell BL21 (Cat. #9126)*2*1: Competent cells prepared from E. coli BL21 strain including one of the chaper-one plasmids are useful for protein expression with pCold DNA series. This prod-uct is not intended for protein expression systems using a T7 promoter, such asthe pET system, because the BL21 strain does not express T7 RNA polymerase.*2: Not available in all geographic locations. Check for availability in your region.NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE[M7] Chaperone plasmidThis product is covered by the claims of U.S. Patent No. 6,159,708 and its foreign counterpart pat-ent claims.[M8] Chaperone plasmidThis product is covered by the claims of JP Patent No. 4249832.pCold is a trademark of TAKARA BIO INC.NOTE : This product is for research use only. It is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals. Also, do not use this product as food, cosmetic, orhousehold item, etc.Takara products may not be resold or transferred, modified for resale or transfer, or usedto manufacture commercial products without written approval from TAKARA BIO INC.If you require licenses for other use, please contact us by phone at +81 77 543 7247 orfrom our website at /doc/8911406802.html.Your use of this product is also subject to compliance with any applicable licensingrequirements described on the product web page. 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TAKARA 高保真酶E说明书
Pyrobest ® DNA Polymerase
使用说明书
TaKaRa Code：DR005A
●包装量：125 U
●制品说明 本制品是 Pyrococcus Sp.由来的具有 3′→5′
dNTP Mixture（各 2.5 mM）
4 μl
模板 DNA（λDNA）*
2.5 ng
引物 1（20 μM）
1 μl
引物 2（20 μM）
1 μl
灭菌蒸馏水
up to 50 μl
*【50 μl PCR 反应体系中模板 DNA 推荐使用量】
人基因组 DNA 大肠杆菌基因组 DNA λDNA 质粒 DNA
●保存温度：-20℃
●活性定义
用活性化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板/引物，在 74℃，30 分钟内，摄入 10 nmol 的全核苷酸为酸 性不溶物的活性定义为 1 个活性单位（U）。
●纯 度 1）10 U 的本酶和 0.6 μg 的λ-Hind III 在 74℃下
反应 1 小时，DNA 的电泳谱带不发生变化。 2）10 U 的 本 酶 和 0.6 μg 的 Supercoiled
2） 以人基因组 DNA 为模板，可很好地扩增 2.9 kbp（p53 基因）的 DNA 片段。
●应用例 以λDNA 为模板进行 PCR 扩增反应
1. 按下列组份配制 PCR 反应液。
Pyrobest DNA Polymerase（5 U/μl）0.25μl
10×Pyrobest Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μl
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● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括 RNase Free dH2O、
Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免 重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2． gDNA Eraser 和 PrimeScript RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存 液中含有 50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不 要使 Tip 插入液面过深，否则会因 Tip 壁粘着造成损失，而使酶量不足。 3． 5×gDNA Eraser Buffer 和 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）在使用前需 Vortex 振荡混匀，轻轻 离心后使用。 4． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。
*5：反转录体系可以根据需要相应扩大。 *6：使用 Gene Specific Primer 时，建议反转录反应条件设置为 42℃ 15 min。PCR 反应有非特
异性扩增时，将温度升到 50℃会有所改善。 *7：合成的 cDNA 需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。 注意：1) 在反转录反应中，SYBR® Green qPCR 法的 RT Primer Mix 用量为 1 μl，TaqMan®
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● 制品说明
为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有 cDNA 作为模板检出的先决条件，但 Total RNA 中常常 混有基因组 DNA，并可以直接作为 PCR 反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这 种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组 DNA 得不到扩增。但是，此方 法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存 在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本 方法。在这种情况下，我们常常需要对 Total RNA 样品进行 DNase I 处理，以除去残存的基因组 DNA。 而 DNase I 处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成 RNA 的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 是可以除去基因组 DNA 进行 Real Time RT-PCR 反应的专 用反转录试剂。Kit 中使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Eraser，通过 42℃，2 min 即可除去基因 组 DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA 分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser 处理后的样品可 以直接进行 15 min 的反转录反应合成 cDNA，因此，20 min 内即可迅速完成从基因组 DNA 去除到 cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与 SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。 注意：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR®为
使用量 12.5 μl 1.0 μl 1.0 μl 2 μl*2 8.5 μl 25 μl
终浓度 1×
0.4 μM*1 0.4 μM*1
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。
◆应用 Thermal Cycler Dice Real Time System 扩增仪的操作方法 1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（2×） PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） RT 反应液（cDNA 溶液） dH2O（灭菌蒸馏水） Total
*3： 含有 dNTP Mixture。
*4： 含有 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers。
*5： 制作标准曲线时梯度稀释 DNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE
Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精
研究用
Code No. RR047A
PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
说明书
v201405Da
目录
内容
● 制品说明 ● 制品内容 ● 试剂盒外必备材料 ●保 存 ●特 长 ● 使用注意 ● 操作方法 ● Real Time PCR ● 实验例 ● 附录 ● 关联产品
400 l
5. RT Primer Mix*4
400 l
6. RNase Free dH2O
1 ml×2
7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5
1 ml
*1： 5×gDNA Eraser Buffer 在反转录反应前使用，请务必进行基因组 DNA 的除去反应。
*2： 含有 RNase Inhibitor。
*4：使用 RT Primer Mix 可以高效合成 cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用 RT Primer Mix， 而选择 Oligo dT Primer 或 Gene Specific Primer 进行反转录反应，引物使用量如下： Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl 反应体系 Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl 反应体系
的最佳试剂。 3． 反转录引物使用了 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 混合的 RT Primer Mix，可以均匀合成样品中的
各种 cDNA。 4． 本制品提供了 SYBR® Green 分析法和 TaqMan®探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选
择体系。 SYBR® Green 分析法和 TaqMan®探针分析法区别如下： 反转录反应中RT Primer Mix的用量。 反转录反应中总 RNA 的用量。 5． Real Time RT PCR 定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总 RNA 和反转录 cDNA 稀释到较低的浓度。如果用水或 TE Buffer 稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结 果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR），将 Total RNA 或 cDNA 稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
使用量 10.0 μl 1.0 μl 4.0 μl 4.0 μl 1.0 μl 20 μl*5
Master Mix 10 μl
37℃ 85℃ 4℃*7
15 min*6 5 c
*3：若不配制 Master Mix，向步骤 1 的反应液中添加试剂时，要先加入 RNase Free dH2O 和 5× PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀，以使 gDNA Eraser 的活性充分受到抑制，再添 加 RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻混匀进行反转录反应。
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1.0 μl
RT Primer Mix *4 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） RNase Free dH2O Total
1.0 μl 4.0 μl 4.0 μl 20 μl*5
Master Mix 10 μl
Probe qPCR 法的用量为 4 μl。 2) 得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过
Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。 -3-
● Real Time PCR
以下是使用本制品进行反转录反应后，选择 SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A/B）进行 Real Time PCR 反应的操作方法。采用 TaqMan®探针法进行检测时，请选择 Premix Ex Taq（Probe qPCR）（Code No.RR390A/B）。
● 操作方法
1. 去除基因组 DNA 反应 按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数 +2 的量配制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA 样品。
试剂
使用量
5×gDNA Eraser Buffer gDNA Eraser Total RNA RNase Free dH2O
Molecular Probes Inc.的注册商标。
● 制品内容（20 l 反应×100 次）
1. gDNA Eraser
100 l
2. 5×gDNA Eraser Buffer*1
200 l
3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2
100 l
4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3
-2-