新基因功能研究的策略和方法
功能基因组学及其研究方法
第22页，幻灯Βιβλιοθήκη 共51页（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
第23页，幻灯片共51时代
第15页，幻灯片共51页
（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，
包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及 其功能。
第16页，幻灯片共51页
根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF）
☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。
研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
第20页，幻灯片共51页
DNA序列分析
基因结构域分析，包括启动子、转录因子 结合序列、内含子、外显子、重复序列、 开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、EST 数据库、STS数据库、Unigene数据库、 Swissprot数据库等。
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计 划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。
植物基因功能研究策略
克隆并分析目标基因启动子序列，鉴定转录因子结合位点和顺式作用 元件，揭示基因表达的调控机制。
蛋白质组学与代谢组学研究
蛋白质组学技术
利用质谱技术对植物蛋白质进行鉴定和定量，分析蛋白质 表达谱和互作网络，揭示蛋白质在植物生长发育和胁迫响 应中的作用。
代谢组学技术
通过高通量代谢物检测技术分析植物体内代谢物组成和含 量变化，研究代谢途径和代谢调控机制，解析基因功能与 代谢表型的关联。
功能冗余与分化分析
比较同一基因家族内不同成员在表达模式、蛋白结构等方 面的差异，分析它们之间的功能冗余与分化情况。
基因家族与表型多样性关联研究
结合自然群体或人工创制的遗传材料，分析基因家族多态 性与表型多样性之间的关联，揭示其在植物适应性进化中 的作用。
CHAPTER 05
植物基因功能研究挑战与展 望
化学诱变
利用化学诱变剂如EMS等处理植物材料，诱导基因突变，结合表型筛选和遗传分析，鉴定 基因功能。
基因表达与调控研究
实时荧光定量PCR
通过特异性引物扩增目标基因，结合荧光信号实时监测PCR产物积 累，用于研究基因在不同组织、发育阶段或胁迫条件下的表达模式 。
转录组测序
对特定生理状态下的植物组织或细胞进行高通量测序，分析转录本 丰度和差异表达基因，揭示基因调控网络和代谢途选目标基 因突变体，分析表型变化以研究基因功能。
基因互补与基因功能恢复验证
01
野生型基因互补
将野生型目标基因转入功能缺失突变体中，观察是否能恢复突变体表型
，从而验证基因功能。
02
等位基因互补
利用等位基因之间的互补性，将等位基因转入突变体中，观察是否能恢
复突变体表型，从而研究等位基因间的功能差异。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
人类基因组中的功能未知基因的鉴定与研究
人类基因组中的功能未知基因的鉴定与研究随着生物学和基因学的快速发展，我们对于人类基因组的了解越来越深入。
但是，仍有很多基因即使被测序也无法确定它们的功能。
这些基因被称为功能未知基因。
尽管这些基因的功能不清楚，但它们可能对人体健康和疾病发展有着重要的作用。
因此，鉴定和研究这些功能未知基因变得至关重要。
一、鉴定功能未知基因功能未知基因的鉴定通常是通过生物信息学方法进行的。
首先，研究人员需要对人类基因组进行测序，然后将测序的信息与已知功能的基因进行比对。
如果一个基因没有与已知功能的基因匹配，那么这个基因就被认为是未知功能的基因。
然而，这种方法只能鉴定一部分功能未知基因。
因为许多基因在不同组织和细胞中都有不同的表达方式和不同的功能，所以只有在特定条件下才能发现它们的作用。
因此，在鉴定未知功能的基因时需要使用多种方法，例如基因表达谱分析、蛋白质互作网络分析和大规模基因消失实验等。
二、功能未知基因的作用虽然我们尚未完全理解功能未知基因的作用，但已有一些研究表明，这些基因可能与许多生物过程相关。
例如，这些基因可能与细胞增殖、分化和凋亡等过程有关。
此外，它们也可能参与免疫系统、神经系统和代谢的调节。
最近，一些研究还发现了一些功能未知基因与肿瘤发展有关。
这些基因可能参与了肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭等过程。
因此，对这些基因的鉴定和研究可能有助于发现新的治疗靶点。
三、研究功能未知基因的挑战尽管在鉴定和分析功能未知基因的方面已经取得了一些进展，但仍存在许多挑战。
一个主要的挑战是如何确定这些基因的功能。
传统上，我们会通过基因敲除或过表达来研究基因的功能。
但这种方法对于功能未知基因并不总是有效，因为这些基因可能在特定条件下才会被表达或发挥作用。
因此，我们需要开发新的技术和方法来研究这些基因的生物学功能。
此外，目前生物信息学技术的不断进步和基因组测序的价格下降使得测序数据不断积累和扩大。
大量的数据使得生物学研究变得愈加复杂，需要用到更为精细的算法和模型来提取和分析数据，因此我们需要不断更新我们的研究方法和技术。
生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧
生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧植物基因改良是指通过调整植物的遗传物质，以改善其农业和生活价值的过程。
近年来，生物大数据技术的快速发展为植物基因改良提供了有力的工具和策略。
生物大数据技术通过收集、整理和分析大规模的基因组、转录组和表达组数据，为植物基因改良提供了宝贵的信息资源。
在这篇文章中，我们将探讨生物大数据技术在植物基因改良中的使用技巧。
首先，生物大数据技术在植物基因改良中的一个重要应用是寻找和分析植物基因组的功能元件。
通过大规模测序技术，研究人员可以获取植物基因组的序列信息，并利用生物信息学方法识别出基因、启动子、转录因子结合位点等功能元件。
这些功能元件为我们理解植物基因组的结构和功能提供了重要线索。
同时，借助生物大数据技术，研究人员还可以对植物基因组进行比较分析，揭示植物物种间的演化关系和基因家族扩张等进化过程，为植物基因改良提供理论基础和方法指导。
其次，生物大数据技术在植物基因改良中的另一个重要应用是基于差异表达分析的基因筛选和功能验证。
差异表达分析是通过比较不同条件下植物基因表达的差异来识别出与特定性状相关的基因。
通过生物大数据技术，研究人员可以获取大规模的转录组数据，并利用差异表达分析方法筛选出不同生长环境或处理条件下显著变化的基因。
这些差异表达的基因可能与植物的耐逆性、抗病性、产量等重要性状相关。
进一步，研究人员可以利用生物大数据技术提供的生信工具，在模型植物中对这些基因进行功能验证和逆境响应分析，以确定其在植物生理和发育过程中的作用，从而为植物基因改良提供有力的候选靶点。
此外，生物大数据技术还可以用于植物基因改良中的功能基因组学研究。
功能基因组学旨在揭示基因与表型之间的关系，通过了解基因在特定生长条件下的功能作用和调控网络，来解释植物表型的形成机制。
生物大数据技术可以提供大规模的基因功能注释和互作网络分析工具，帮助研究人员解析植物基因调控网络和信号途径。
这些信息可以帮助我们更好地理解植物特定性状的调控机制，为植物基因改良提供指导和策略。
解析基因疗法四种治疗策略
解析基因疗法四种治疗策略基因疗法是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
它通过修复、替换或调节人体细胞内的异常基因或缺失基因，以达到治疗疾病的目的。
基因疗法的治疗策略可以分为四种：基因替代疗法、基因修复疗法、基因靶向疗法和基因调节疗法。
首先，基因替代疗法是指将正常基因导入到患者体内，以取代异常或缺失的基因。
这种策略主要应用于单基因遗传疾病的治疗。
通过载体（如病毒）将正常基因导入细胞中，确保它们能够正常表达。
这样，缺失基因或异常基因就可以被替代，同时恢复相关蛋白质的正常功能。
例如，通过基因替代疗法，可以治疗囊性纤维化、血友病等遗传疾病。
其次，基因修复疗法是指通过修复异常基因中的缺陷来治疗疾病。
修复可以包括修复基因序列上的点突变、插入或缺失。
这种策略一般应用于遗传性疾病，特别是那些由单个基因突变引起的疾病。
基因修复疗法的其中一种方法是利用CRISPR-Cas9系统，通过引导RNA（gRNA）的作用，将Cas9蛋白和修复DNA片段导入细胞中，使其定向修复基因序列上的缺陷。
这种方法在修复囊性纤维化相关基因中的突变上已经取得了一些成功。
第三，基因靶向疗法是指利用RNA干扰或抗义RNA等方法来靶向抑制或抑制特定异常基因的表达。
这种策略主要应用于引发疾病的一些突变基因表达的恶性扩张，如癌症等。
通过设计特定的小分子RNA（siRNA）或miRNA来靶向抑制突变基因的表达，可以达到抑制肿瘤生长、转化或治疗其他疾病的目的。
例如，在治疗癌症中，可以通过RNA干扰技术抑制癌细胞中的特定增殖信号通路或抗凋亡基因的表达。
最后，基因调节疗法是指通过促进或抑制特定基因的表达，来调节人体细胞内的基因功能。
这种策略主要应用于调节基因表达与信号传导通路等方面的治疗。
通过设计特定的基因序列或siRNA，可以实现对基因表达的调节。
例如，通过对一些细胞因子的基因表达进行调节，可以增强免疫反应或抗凋亡能力，从而促进治疗效果。
总结起来，基因疗法的治疗策略包括基因替代疗法、基因修复疗法、基因靶向疗法和基因调节疗法。
功能基因组学研究概述
3.融合了全基因组鸟枪法和逐步克隆法绘制的牛基因组草 图，包含了26052388个可用测序读长，覆盖约7.0倍基因 组，拼接成2.87Gb的基因组序列。
2.牛基因组学
研究进展
截止到 2006年 6月 15日为止，GenBank 中牛的mRNA、EST等序列数目达到 914 944条，这些序列拼接得到 37 225 个 clusters，是转录水平获得序列最多的家 养动物。目前已经建成织细胞的基因表达 情况奠定了基础。
白质物理性质预测(如等电点、分子量、酶切特性、疏水性 等)。蛋白质结构预测（蛋白质二、三级结构及特殊结构预 测）、蛋白质功能的预测（通过相似序列的数据库比对确定 功能、确定序列特性、通过序列模体数据库等的比对确定功 能）
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3.1新基因的生物信息学分析（基因结构及编码产物
功能预测)
3.1.3新基因的功能预测:序列同源比较:主要方法有同源检索
(NCBI数据库的 Blastn)和多序列对齐 (multiple sequence alignment,MSA)
3.1.4蛋白质结构与功能预测：从氨基酸组成辨识蛋白质、蛋
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
新基因全长cDNA的克隆策略
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
基因组学研究的新技术与新方法
基因组学研究的新技术与新方法随着科技的不断发展，基因组学研究也在快速进步着。
从最初的Sanger测序到现在的高通量测序技术，基因组学研究不断涌现新的技术与方法。
本文将介绍一些基因组学研究的新技术与方法，并探讨其在基因组学研究中的应用。
一、单细胞测序技术单细胞测序技术是指通过对单个生物细胞进行基因组、转录组或表观基因组的测序，获得该细胞的完整信息。
相比于传统的混合细胞测序，单细胞测序技术具有更高的分辨率和灵敏度。
单细胞测序技术主要分为两种，一种是单细胞全基因组测序技术（single-cell whole genome sequencing，scWGS），另一种是单细胞转录组测序技术（single-cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）。
在scWGS技术中，通过将单个细胞的基因组DNA进行扩增、建库和测序分析，可以获得单个细胞完整的基因组信息。
而在scRNA-seq技术中，则是将单个细胞的mRNA转录本进行扩增、建库和测序分析，获得单个细胞转录组的信息。
单细胞测序技术在各个领域都有着广泛的应用，如在肿瘤学中可以研究不同癌细胞的异质性，从而更好地了解癌症的发生机制和治疗策略；在演化生物学中可以深入研究物种的起源和演化；在发育生物学和神经科学中则可以探究单个细胞发育及神经元分类等问题。
二、DNA甲基化测序技术DNA甲基化是指DNA分子上甲基在胞嘧啶环上发生加成反应，从而形成5-甲基胞嘧啶。
这种化学修饰是细胞表观基因组调控的一种重要方式。
DNA甲基化测序技术是指对DNA分子进行甲基化信息的测序，以描绘基因组DNA上甲基化分布情况。
这类测序技术主要包括甲基化敏感限制性内切酶测序（methyl-sensitive restriction endonuclease sequencing, MRE-seq）、嵌入式甲基化测序（bisulfite sequencing, BS-seq）和甲基化免疫沉淀测序（methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq）等。
基因功能分析的基本策略
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
一、转基因动物
转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基 因的动物。 转基因过程： 1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。
启动子
结构基因
转基因载体
报告基因
注射
增强子
转基因小鼠
Southern blot
二章基因功能分析的基本策略
基因功能是在细胞组成的多层次的复杂生命体中实现 的，因此对基因功能的研究将极大程度上依赖于对模 式生物的研究。
基因敲除技术、转基因动物模型、基因转染细胞模型、 干涉技术的发展，成为基因功能分析的有力工具。
第一节 利用转基因模型研究基因的能
利用动物模型研究未知基因的功能，就是将某 一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物 基因组，产生在遗传上经过基因工程修饰（改造） 的动物，实现在整体动物、细胞或分子水平上认识 基因的功能或人类疾病发生的分子机制。
稳定转染细胞基本过程：1、真核重组表达质粒的构建： 将外源基因和真核表达质粒连接构建成重组质粒；2、在 原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；3、将 重组表达质粒转染哺乳动物细胞；4、重组质粒转染细胞 的克隆化筛选、保存；5、转染细胞表达目的蛋白、提取、 鉴定。
生物化学第三节 基因的生物学功能鉴定技术
第三节基因的生物学功能鉴定技术2015-07-16 71002 0人类基因组计划虽然解析了基因序列，但绝大多数基因的功能尚不清楚。
因此，利用各种技术手段研究基因的功能将是“后基因组时代”的主要内容之一。
基因功能的确定必须通过实验来验证。
通常采用基因功能获得和（或）基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中所导致的细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而从正反两方面对基因的功能进行鉴定。
此外，基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。
由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此，从整体水平研究基因的功能是必然的选择。
一、用功能获得策略鉴定基因功能基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导人某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。
常用的方法有转基因技术和基因敲入技术。
（一）用转基因技术获得基因功能转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞(embryonic stem cell)，即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。
转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。
在转基因动物中，以转基因小鼠最为常见。
建立转基因小鼠的常用方法有两种，一是直接将目的DNA显微注射到受精卵的雄性原核，然后植入假孕母鼠体内，使之发育成幼仔；二是将带有目的基因的ES细胞注射到囊胚，然后在小鼠体内发育成幼仔。
在出生的动物中即含有在一个等位基因的位点进行了DNA整合的小鼠，即转基因杂合子。
经子代杂合子交配，在其后代中可筛选到纯合子（图22-7）。
表型研究、功能研究、机制研究
表型研究、功能研究、机制研究是生物医学领域中重要的研究内容。
本文将从这三个方面对这些研究进行探讨。
一、表型研究表型研究是指对生物体在形态、结构、生长发育等方面的特征进行系统观察和描述的研究。
表型研究既包括对整体表型特征的描述，也包括对细胞、器官、组织的特征的描述。
通过表型研究，可以全面了解生物体的生理功能和遗传变异等情况，为疾病的诊断、治疗提供重要依据。
表型研究在基因功能的研究中起着至关重要的作用，同时也对药物研发和临床诊疗具有重要意义。
二、功能研究功能研究是指对生物体各个组成部分的功能进行深入了解的研究。
包括对蛋白质、基因、细胞器等功能的研究。
功能研究可以通过各种生物学实验手段，如基因敲除、蛋白质互作实验等，揭示生物体的各种生理和生化活动的特点和规律，从而揭示疾病的发生机制。
功能研究不仅对基础生物学研究有重要意义，同时也对疾病的治疗和药物的研发有重要作用。
三、机制研究机制研究是对生物体在生理、生化等方面的活动机制进行研究的过程。
机制研究不仅包括对某一生物学过程的具体机制的研究，同时也包括对不同生物学过程之间相互作用的机制研究。
在临床医学中，探究细胞内的信号转导通路、基因调控等机制，可以为疾病的发生、发展提供重要线索，为疾病的治疗提供新的靶点。
表型研究、功能研究、机制研究是现代生物医学研究中十分重要的三个方面。
它们相互通联、相互促进，共同推动着我国生物医学领域的发展。
希望科研工作者在这三个方面的研究中，不断深耕细作，为生物医学领域的进步做出更大的贡献。
在生物医学研究领域，表型研究、功能研究和机制研究是三个密不可分的方面，它们相辅相成，互相促进。
在过去的几十年中，这三个领域取得了巨大的进展，为科学家们提供了更多的工具和技术来解析生物体的组成和功能，并且为疾病的治疗和预防提供了更多的线索。
下面就分别来探讨一下这三个方面的进展和应用。
1、表型研究表型研究对于全面了解生物体的生理功能和遗传变异具有重要意义。
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对于一个陌生的基因，我们该怎么认识她？
你是谁？→从功能强大的“基
因族谱”——数据库中找“亲戚”
A
到哪里去？→任你乔装易容，你
还是你：从产物着手，顺藤摸瓜
C
B 从哪里来？→上帝才知道
D
价值作用？→你在或者不在，
世界还是一样吗？
你是谁？
生物信息学 分析
1.编码产物序列分析 2.序列同源性分析 3.蛋白质功能域分析
价值作用之“无中生有”
基因功能 获得
基因转染技术 转基因技术
基因转染技术
研究特定基因的 功能
筛选高表达转染 基因的细胞
将基因导入细胞 并鉴定
特定基因的克隆
基因转染技术：通过生化或者物理方法将目 的基因导入真核细胞中 ，并在细胞内表达。
转基因技术
外源目的基因 的分离
转基因载体的 构建
转基因胚胎的 培养和移植
导入受精卵或 胚胎干细胞
转基因动物的 检测鉴定和品
系筛选
研究特定基因 在体内的功能
价值作用之“有中生无”
基因功能 失活
基因沉默技术 基因敲除技术
基因沉默技术
基因敲除技术
生物信息学分析
全长cDNA序列查找开放阅 读框→推导蛋白质氨基酸序列 →信号肽预测分析→蛋白质理 化性质分析→预测其高级结构
以新基因的cDNA 序列来对基因组数 据库进行同源性比 对，获得与其完全 同源的基因组DNA 序列及其染SITE 数据库分析蛋白 质功能域
到哪里去？
体内表达 规律分析
mRNA水平的表达谱分析 蛋白质水平的表达分析
体内表达规律分析
mRNA水平 的表达谱分
析
半定量RT-PCR,实时定 量RT-PCR和Northern Blot等检测mRNA的表 达水平
蛋白质水平 的表达分析
制备相应的抗体来检测其 蛋白质终产物的表达情况， 如该蛋白质表达的亚细胞 定位、分子质量大小、聚 体形式等