柱层析色谱实验操作

塔板理论
基于热力学的塔板理论
它是色谱学的基础理论，塔板理 论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离 组分在分馏塔的塔板间移动，在每一 个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动， 组分分子不断从一个塔板移动到下一 个塔板，并不断形成新的平衡。一个 色谱柱的塔板数越多，则其分离效果 就越好。
基本操作程序
清洗 检查柱子
洗脱：根据TLC 情况配置洗脱液
装柱：干法， 湿法
收集：检测 方法选择
上样：干法， 湿法
使用常压或减压蒸馏， 冻干等方法除去溶剂
1、装柱
装柱前，柱子应干净、干燥 ，并垂直固定在铁架台上。将少量 洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛 或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中， 用一长玻璃棒轻轻送到底部，适当 捣压赶出棉团中的气泡，但不能压 得太紧，以免阻碍溶剂畅流（如管 子带有筛板，则可省略该步操作） 。

2.如果还不行，就用高极性的溶剂冲下样品，收集，重新装柱。
上样
干法： 把待分离的样品用少量溶剂溶解后，
在加入少量硅胶（一般是样品的1~2倍量）， 拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小 心加到柱子的顶层。
干法上样较麻烦，但可以保证样品层很 平整。 而且适用于溶解性差的样品，
湿法
湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂， 如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大 的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头 滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。
流动相体系的选择
首先从待分离物质的结构上判断
1. 极性基团较多的，如胺基、羧基，选择极性 较大的体系。一般为甲醇：氯仿体系，
2. 可形成氢键部位较多的，应选择极性较大的 流动相体系
3. 脂溶性集团较多的，一般乙酸乙酯：石油醚 体系就可以
流动相体系的选择
由TLC实验数据推断柱层析流动相配比：
碱性物质也可以使用硅胶分离，但需要用 三乙胺等碱性物质碱化吸附剂
如果选择氧化铝分离，需要使用氧化铝TLC 板点板，使用硅胶板不能准确选择流动相 体系
吸附剂的选择
吸附剂目数的选择 对于Rf值>0.4的杂质，可以选择目数100~200的
硅胶 对于Rf值在0.2~0.4的，一般用200~300目 对于Rf值在0.1~0.2的，用300~400目 对于Rf值<0.1的，需要更多的吸附剂用量、较小
流动相体系
正己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二 硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯 <丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统（有时样品溶 解性差的可以加入二氯甲烷）
极性较大的用 甲醇：二氯甲烷系统 极性大的用 甲醇：水：正丁醇：醋酸系统
对洗脱液接收时，有色物质，按色带进行收集，但色带 之间两组分会有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份 连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若 洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量 就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分 离情况而定。现在，多数用分步接收器自动控制接收。
流动相体系的选择
特殊样品：会造成拖尾，严重影响分离效果 碱性物质
洗脱剂中加千分之一的三乙胺，或用千分之一到百分之 一的氨水、三乙胺或者氨甲醇，碱化柱子。
酸性物质
洗脱剂中加千分之一的醋酸。
如果流动相中加入酸碱，再洗脱完毕时，有必要时应水 洗除去洗脱剂中的酸碱。
层析柱的选择
关于柱子的尺寸，应该是粗长 的最好 ：横截面/高度比
塔板理论
理论塔板高度越低，在单位 长度色谱柱中就有越高的塔 板数，则分离效果就越好。
决定理论塔板高度的因素有： 固定相的材质、色谱柱的均 匀程度、流动相的理化性质 以及流动相的流速等。
速率理论----范式方程
➢ 1956 年荷兰学者 van Deemter 等在研究气液色谱时提出 ➢ 色谱过程动力学理论 ➢ 应用了塔板理论板高 H 的概念 ➢ 充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 ➢ 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级 洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用 。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。 它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值 等。最常用的是浓度梯度。
优点：简便
缺点：使用湿法则需要较多的溶剂，导致上 样层变厚，分离效果不好。
洗脱与检测
在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱 三种。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止 。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或 洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适 方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
匀的点在板的下方，吹干溶剂，放入展缸展开。 显色或UV确定所要色带，将所需要的色带用小刀
刮下，硅胶用溶解性好的溶剂浸泡，过滤，浓缩， 即可得到产物。
优点：与TLC板情况比较吻合，操作简便，柱效 高，分离效果好。
柱层析色谱
基本原理
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在 两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同 来进行分离的。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与 固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随 着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次 的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不 同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适 当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的 分离与检测。
洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度 和吸附剂的活性来选择。所用洗脱剂的浓度大小 和极性强弱的选择，需通过试验确定。
在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极 性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性 大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合 使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原 则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用 量少、洗脱时间短。
的流动相体系、较长的时间
洗脱剂的选择
洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。洗脱 剂的选择基本按照“相似相溶”的原则， 即：即欲洗脱极性大的组分，选择极性大的洗脱剂（如水、乙 醇、氨等）；极性小的组分宜选用极性小的洗脱剂（如石油 醚、乙醚等）， 并应符合下列条件：①纯度较高；②稳定性好；③能较完全洗 脱所分离的成分；④黏度小；⑤易和所需要的成分分开。
传质阻抗项(C·u) 产生原因：组分在两相间分配，组分未及溶解就被带走或者 进入固定相的组分未及解吸，从而造成峰扩张。
速率理论
分类
柱层析方法分类： 吸附色谱柱：吸附剂，洗脱剂（流动相）； 分配色谱柱（萃取原理）：载体，固定相， 流动相； 离子交换树脂柱； 凝胶柱
吸附色谱柱较为常用，下面重点讨论
再 在 上 面 加 入 一 层 约 0.5cm 厚的洁净细砂，轻扣击柱管，使砂 面平整。
装柱
干法
直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧， 至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度， 最后再用气泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用洗脱剂“走柱子”，一般洗脱剂是采用TLC 分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面 加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较 方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶 之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产 生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲 烷更为明显。
在选择一定的流动相的前提下，调整流动相组分或比例，使目标 物的Rf值为0.2~0.3，与邻近杂质的分离度最好在0.1以上（当然是 越大越好，Rf达到0.2~0.3就很容易分离了）
根据所选的吸附剂的目数
因为TLC是高效板，硅胶柱的分离效果较差，所以一般需要在 TLC流动相的基础上放大5~10倍，甚至更多才可以得到相似的分离 度
吸附剂
硅胶 中性、酸性，比较适合分离中性或酸性物质 粒度100~200目，200~300目，300~400目，更 高
氧化铝 酸性，适合分离酸性物质 中性，pH值7.5，适合分离碱性物质 碱性，pH值10，适合分离碱性物质
聚酰胺 硅藻土 活性炭
吸附剂的选择
中性、酸性物质优先试用硅胶分离，如果 效果不好可以使用氧化铝
湿法：
先把硅胶用适当的溶 剂拌匀后，再填入柱子中， 然后再加压用淋洗剂 “走柱 子”，本法最大的优点是一 般柱子装的比较结实，没有 气泡。
无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松 紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成 “沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。
气泡的产生与排除
气泡产生原因 由于溶剂和吸附剂之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产
生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然 产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加 溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花。另外，在 变换洗脱剂时，由于溶剂极性的改变页容易产生气泡；天气太热，溶剂挥发 也易产生气泡。 排除对策： 1.装柱之前应搅拌均匀，然后装柱； 2.装柱尽可能一次性的装完， 3.一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到 室温后再撤去压力 4.过柱的时候，你是否干过柱，这也会产生气泡； 5.在装完柱后，最好在硅胶上方加一片圆形滤纸，加上后再加一块棉花，这 样加溶剂冲洗时，可以避免冲起硅胶，产生气泡； 如果气泡已经产生，可以： 1.加压驱赶气泡；
van Deemter方程的数学简化式为
H

A

B u
Cu
涡流扩散项：A (1) 产生原因
载气携样品进入色谱柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 → 路 径不同→涡流扩散 (2) 影响因素：
固定相颗粒越小越均匀，填充越均匀，A 项越小
分子扩散项（纵向扩散项）：B/u, B＝2γDm 产生原因： 组分在色谱柱内被流动相推动向前、展开 → 浓度梯度 → 谱带展宽
洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外 光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱 曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分 的较纯样品。
制备板分离
原理同TLC
展
制备板：吸附剂GFቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ54
开 方
向
0.3~0.4mm
载样量<100mg 点样处
操作流程
将样品溶解，用0.5或0.9mm毛细管将样品均
根据待分离的样品的量进行选 择：装柱太短了可能分离效果不
好，太长了也会由于扩散或拖尾导 致分离效果不好，同时浪费时间， 不稳定的物质还可能会变质。
A
B
一般的策略
目标产物与杂质Rf值相差较大(>0.2)的样品 小目数吸附剂，较大极性，快速过柱
目标产物与杂质Rf值相差很小（0.1~0.2）难以分 离的样品 增加吸附剂的目数和用量，减小洗脱极性， 延长洗脱时间； 或者先进行粗分，除去容易出去的杂质，再 二次层析