微生物大小测定和显微镜直接计数

实验五微生物大小测定和显微镜直接计数

一、实验目的：

1、了解显微测微尺的结构；

2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法；

3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法；

4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。

二、实验原理：

1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物

细胞的长度.目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间镜台测微尺的格数×10/两条重合线间目镜测微尺的格数

2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察

1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104×稀释倍数

本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中

三、实验步骤：

（一）微生物大小的测定：

1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒

2、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度

3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行

4、按公式计算目镜测微尺每格的长度

5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10个菌体的长宽，求其平均值，用长（μm)*宽（μm）表示

（二）显微镜直接计数

1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释10倍

2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数

3、在计数室移至视野中央，选取25中格（4觉与中央）计含菌数，重复计数2-4个计数室内的含菌量，求其平均值。

四、材料和器皿：

酵母菌液，显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，擦镜纸，二甲苯，血细胞计数板，配套的计数板厚盖玻片，试管，移液管，吸水纸。

五、实验结果：

10倍镜下目镜测微尺的实际每个长度：（5/10）×10=5um；

40倍镜下目镜测微尺每格的实际长度：（10/80）×10=1.25um。

分别列表5个酵母菌的长和宽，计算其平均值（10倍镜下）

1 2 3 4 5 平均值

长 1.8 1.5 1.0 2.4 2.0 1.7

实际长度9.0 7.5 5.0 12.0 10.0

宽 2.0 1.6 1.2 2.2 2.4 1.1

实际宽度10.0 8.0 6.0 11.0 12.0

分别列表5个酵母菌的长和宽，计算其平均值（40倍镜下）

1 2 3 4 5 平均值

长7.2 9.2 8.3 6.8 7.4 7.8

实际长度9.0 11.5 10.4 8.5 9.3 9.6

宽 6.9 9.0 8.0 7.2 7.0 7.6

实际宽度8.6 11.3 10.0 9.0 8.8 9.5

长（μm）＝9.6 宽（μm）＝9.5

大小（μm2）=9.6*9.5

计菌总数

中格菌数大格总菌数稀释倍数菌数（个/mL）

x1 x2 x3 x4 x5 （平均值）

第一室 17 39 29 23 30 29 10 7×107

第二室 32 36 30 24 28 30 10

7.5×107

结果分析：

1）10倍镜和40倍镜的放大精确度不同。

2）血细胞板计数所计数的有活菌、有死菌，结果代表总的细菌值。

3）此计数法采用计上不计下，计左不计右的原则。

六、回答问题

1、在某架显微镜下使用某一放大倍数的物镜，测得目镜测微尺的每个实际长度，当换一架显微镜用同样放大倍数的物镜时，该尺度是否还有效？为什么？

1、答：无效，显微镜与显微镜之间目镜的放大倍数，或物镜的放大倍数间有一定误差。虽都标有10*或40*，但可能由于制造过程的误差，会出现不同的放大倍数，其次由于人眼

观察造成误差，显微镜下两线平行并重合，会因不同人的观察时间的不同引起读数不一致，因此在第一次测得每格实际长度后，换一架显微镜即使为同样倍数的物镜，该尺度无效需要重新测量。

2、试分析影响本实验的误差来源及提出改进措施。

2、答：误差来源可能为样品没有摇匀．计数室内有气泡．读数因人而异．样品小室有液体流动．或器材上留有菌液，细胞识别错误等。可采用的措施包括样品一定要摇均匀，如果有气泡就一定要重新做．读数时速度要快．所用器材均应清洁干燥，应等样品小室内液体稳定后再进行读数，并对细胞进行正确的识别。同时也有可能是由于滴加的液体样品较少，没有充满样品市，在计数时计数室的样品数不均匀，造成计数偏差。七.总结与分析:

再用显微测微尺测量酵母菌的大小时，由于做好片子后没有用吸水纸吸去多余的液体，造成片子中的酵母细胞呈流动状态，因此误差较大。