疾病相关基因的发现及功能研究@

第二次杂交
☻ 合并两份杂交产物，另加上新的变性 control单链，再次杂交退火
☻ 只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减 的单链test cDNA能与control cDNA一起 形成各种双链分子
☻ 这次杂交进一步富集了差异表达基因的 cDNA,并产生了一种新的双链分子e，这种 分子的两个5'端有两个不同的接头，正是由 于这两个不同的接头，使其能在以后的 PCR中被有效地扩增。
缺点
☻ 但RDA无法检测缺乏合适内切酶位点的表 达序列
☻ 类似抑制差异杂交技术，它只能获得较短 的靶基因探针，用几个甚至几十个探针分 别去筛选全长cDNA绝不是一件容易的事情
☻另一方面cDNA RDA降低复杂性也可能造 成一些信息的丢失
D、mRNA DD RT-PCR
☻mRNA differential display RT-PCR Three techniques
A、差减杂交(subtractive hybridization)
☻差减杂交是利用目的基因在两种组织 或细胞中表达的差异，通过其mRNA 或单链cDNA进行液相杂交，除去两者 之间相同的基因成分取得。
Control Experiment mRNA
RT→cDNA 标记生物素 不标记生物素
Hybridization 生物素亲和层析柱 未结合的洗脱下来
☻ 翻译水平: protein electrophoresis
转录水平
方法基本要求
寻找mRNA 表达的差异, 至少要满足下列要求 ☻在一定时、空里,约有15 000 种mRNA表达
/cell, 除少数属高丰度、大量的属于低丰度表 达, 使用的方法足以显示低丰度mRNA ☻重复性要好 ☻实验过程中能够步步验证比较 ☻得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs , 并能由此找到相应的cDNA序列 ☻ 省时,简便易行
克隆、测序 得到差异表达基因
优点
☻利用降低了复杂度的差减文库进一步 作差异杂交，能够显著提高差异杂交 的效率
缺点
☻目的基因片段的富集程度有限 ☻假阳性比例较高 ☻需大量的mRNA(>20mg)
B、抑制差减杂交(supression subtractive hybridization ,SSH)
☻ 原理：以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交 方法：利用非目标序列片段两端的长反向 重复序列在退火时产生“锅一柄”结构， 无法与引物配对，从而选择性地抑制非目 标序列的扩增
抑制消减杂交法的优点
☻降低假阳性率 ☻ 两步杂交和两步PCR，保证了该方法具有
较高的特异性 ☻ 具有高度敏感性：它的均等化和对目标片
段的富集，保证了低丰度mRNA也有被检 测的可能
抑制消减杂交法的缺点
☻ 该方法若是mRNA量不够，那么低丰度的 差异表达基因的cDNA很可能会检测不到
☻ 其次，消减库中的cDNA因为已被限制酶 消化，不再是全长cDNA
☻ 步骤繁琐，工作量大
C、限制型差异显示PCR
☻ mRNA反转录成双链cDNA ☻ 再用同一限制酶(首先识别4bp的酶)消化
cDNA ☻ 并把酶切片段分别加上接头后进行特异
PCR扩增 ☻获ห้องสมุดไป่ตู้差异表达片段
优点
☻通过使用限制酶将cDNA杂交度降低 ☻降低了杂交后无关重复序列对富集的
靶序列的污染 ☻假阳性率相对低得多
☻ 每一特定发育时期或每种组织特异表达其基 本与独特的蛋白质
☻ 正常成人体内约含有250种以上不同类型细胞
☻ 每种细胞大约表达300—400种不同于其他细 胞的特异性蛋白质
☻ 脊椎动物细胞总蛋白的35％---80％在各种组 织之间互不相同而构成所谓标志蛋白，也称 看家基因
☻ 如糖代谢、DNA修饰和蛋白合成等有关酶的 选择性表达基因多为低丰度的基因
☻ 我们对其中绝大部分基因及表达产物功能尚 不了解，在疾病中的意义不明
基因的表达调控
基因的表达主要是通过： ☻控制转录
转录的启动 转录的速度 转录后的修饰 ☻控制翻译实现 翻译的启动 翻译后的修饰
基因差异性表达的研究策略
☻ 转录水平：差异性表达mRNA 水平分析 a. DD RT-PCR技术 b. 差减杂交 c. 抑制差减杂交 d. 基因表达系列分析(SAGE)
巢式(Nest) PCR
☻ 两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式 PCR(nested PCR)原理进行扩增
☻ e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高 ☻ c型的双链分子只在一端有一个引物配对，
扩增效率比e型分子低得多 ☻ b型分子由于两端有长序列的反向重复，可
互补形成牢固的“锅一柄”二级结构，无 法进行有效扩增 ☻ e就是差异表达的基因
使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含 量达到基本一致
原理
☻ 丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交 的速度要快于丰度低的单链cDNA.
目的
☻由于test cDNA中和control cDNA序列相似 的片段大都和control形成异源双链分子C， 使test cDNA中的差异表达基因的cDNA得 到大量富集
☻RT: Reverse-Transcription: ☻PCR: Polymerase Chain Reaction ☻PAGE Sequence gel electrophoresis
Test
Control
mRNA RT→cDNA RsaI/ HaeIII酶切
Test cDNA分成两部分
连上接头
连上接头
加入过量的control cDNA 变性后杂交
第一次杂交
第一次杂交后有4种产物： ☻ a是单链test cDNA ☻ b是自身退火的test cDNA双链 ☻ C是test和control的异源双链 ☻ d是单链control cDNA 目的 第一次杂交是使test单链cDNA均等化，
疾病相关基因的筛选 及其功能研究
生物体基因表达
☻多细胞生物的正常生长、发育、衰老 以及病理状态下组织细胞的结构与功 能的变化，归根结底为基因
☻在一定时间上 ☻在一定空间上
的选择性表达，即基因的差异性表达
人类基因组及表达概况
☻人类单倍体基因组由3.2xl06bp DNA组成，含 有2～3万个基因
☻ 在一般情况下任何类型的细胞大约只表达一 部分基因，约产生5 000-15 000种蛋白质