杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定
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在对448份样品进行品种真实性和纯度检测中，SSR分 子标记鉴定结果在样品抽检后的300d内就出来了，而田间 种植鉴定从第2年4月份开始育苗到8月份进行鉴定，这期间 很多种子已经卖给农民种到地里，不合格种子已经给农民 造成减产减收不可挽回的经济损失。由此可见， SSR分子 标记鉴定水稻品种真实性和纯度的方法，其结果与田间鉴 定结果一致，且检测时间短，能迅速为种子监管工作提共 技术支撑和决策依据，减少不合格种子带来的经济损失和 社会不良影响。
SSR引物来自中华人民共和国农业行业标准NY/ T1433-2007上公布的引物序列，并由上海英骏生物技术有 限公司合成。PCR反应体积为10µL，其中含模板1.0µL (浓 度为50ng/µL)，2*Taq PCR MasterMix 6.0µL(天根生化科技， 北京), 正反向引物各0.5µL(50ng/µL)。PCR反应条件为94℃变 性4min，94℃变性30s，56℃ 退火30s，72℃延伸1min，34 个循环，再72℃延伸7min，12℃保存。PCR扩增完成后， 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染后观察统计带型。 1.2.4 田间种植鉴定
33 311 真实性不合格 性状不典型
34 350
未检测
性状不典型 无标准样品
35 359 真实性不合格 性状不典型
36 362
未检测
性状不典型 无标准样品
37 363
未检测
性状不典型 无标准样品
38 365
未检测
性状不典型 无标准样品
39 366
未检测
性状不典型 无标准样品
40 367
未检测
性状不典型 无标准样品
17 216 真实性不合格 性状不典型
18 217 真实性不合格 性状不典型
19 219 真实性不合格 性状不典型
20 227 真实性不合格 性状不典型
21 248 真实性不合格 性状不典型
22 269 真实性不合格 性状不典型
23 270 真实性不合格
田间无对照
24 271 真实性不合格 性状不典型
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料均为杂交水稻种子，共459份样品。其中材 料一11份，为一般委托鉴定样品；材料二448份，由全国 农技推广中心提供的市场抽检样品。 1.2 方法
1.2.1 发芽
发芽按照《农作物种子检验规程》(GB/T3543.4—1995) 要求，每个样品随机取220粒种子，均匀置于发芽床上，温 度为30℃、光照为750Lx、湿度为75%的条件下发芽7~10d。 1.2.2 DNA提取
41 368
未检测
性状不典型 无标准样品
42 377
未检测
性状不典型 无标准样品
43 379 真实性不合格 性状不典型
44 415 真实性不合格 性状不典型
46 417
未检测
性状不典型 无标准样品
47 419
未检测
性状不典型 无标准样品
48 425
未检测
性状不典型 无标准样品
纯度鉴定实验材料总DNA的提取采用单株快速提取 法，取正常发芽的192颗水稻幼苗，剪取中间粗壮部分 1~2cm，用镊子放入96孔PCR板的孔中，每孔加入40µL 0.25mol/L NaOH，在沸水中煮30s，然后加入40µL DNA 0.25mol/L HCL，20 µL 0.25mol/L Tris(pH8.0，含有体积 分数为0.5%的IGEPAL-CA630)的混合液，在沸水中煮沸 2min，取1µL进行PCR扩增。
用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433-2007中公 布的24对引物，以农业部提供的标准样品作为对照，对448 份样品进行品种真实性鉴定，通过6%非变性聚丙烯酰胺进 行电泳，共检测出37份样品真实性不合格(表2)。将SSR分 子标记鉴定结果与田间品种真实性鉴定结果进行比较，有 13个样品没有标准样品，未做SSR鉴定外，有6个样品田间 没有对照样品，未进行田间鉴定，其余429个样品鉴定结果 与田间鉴定结果一致，这充分说明利用SSR分子标记技术 鉴定品种真实性和纯度，其结果可靠、准确。
3 讨论与结论
我国已加入WTO，经济的发展不仅需要健全良好的市 场环境秩序，而且需要消除技术壁垒，实现与国际的顺利接 轨。水稻是我国的主要粮食作物，播种面积大，为了适应经 济发展新形势，杂交水稻研究与开发中的知识产权保护工作 尤显重要。为此，加强与改进品种鉴定工作是形势所需。把 先进的DNA分子标记技术应用于杂交水稻品种真实性和纯度 鉴定，并使其标准化，这不仅可以防止假冒种子充斥市场， 而且将为中国杂交水稻在走向世界的进程中，维护其在国际 市场上的权威性提供重要的保障。
2 结果与分析
用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433-2007中 公布的24对引物，对实验材料一中11份样品进行PCR扩
34 种子世界 2014 . 3
科学实验
Scientific Experiment
表2 品种真实性SSR分子标记鉴定与田间小区种植鉴定结果比较
序 样品 SSR分子标记 田间种植
49 445 真实性不合格 性状不典型
50 448 真实性不合格 性状不典型
增，通过6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果，谱带中 出现双亲互补带型的为杂交种，母本纯合带型推测为育性 恢复的不育系，其他带型推测为其他杂株，以此计算纯度 的百分率。SSR分子标记鉴定结果与田间小区种植鉴定结果 比较显示(表1)，两种鉴定结果都低于国家质量标准，判定 为不合格。SSR分子鉴定结果略低于田间小区种植鉴定结 果，前者鉴定结果平均值为86.6%，后者鉴定结果平均值为 87.3%，两者相差0.7%。纯度值差异最大为4号样品，相差 8.8%，差异最小为9号样品，仅差0.9%。
目前，在海南进行异地异季小区种植鉴定是我国杂 交水稻品种纯度和真实性鉴定的主要手段之一。但海南异 地异季鉴定的光照气候条件与正季种植光照气候条件的差 异，导致植株的性状表现有差异，这要求鉴定人员要对鉴 定样品的特征特性非常熟悉，且田间小区种植鉴定时间 长、费用高。相对田间小区种植鉴定，SSR 标记鉴定杂交 水稻品种纯度和真实性具有快速、便捷、费用低等优势， 非常适合我国目前种子公司应用要求。
真实性鉴定样品种子总DNA提取，采用植物基因组 DNA提取试剂盒(天根生化科技，北京)，具体方法为：1.处
表1 田间小区种植鉴定与SSR分子标记鉴定结果比较
样品 编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 判定结果
田间检 测值 87.9 90.8 85.0 91.3 88.5 88.2 90.2 91.9 84.7 82.4 79.7 不合格
由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基 因间差异很大。因此，这一技术很快便发展为一种分子标 记。在各种DNA分子标记中，SSR标记应用于杂交种的鉴定 和纯度检测，具有很大的优越性。首先，SSR标记的引物是 根据重复序列两端相对保守的单拷贝序列设计，其扩增产 物稳定，建立的指纹图谱可靠。其次，SSR作为共显性标 记，比显性标记提供更多的信息，而且SSR位点具有复等位 性，可在种内的栽培品种之间获得多态性标记位点。
分子 检测值
90.0 89.7 81.1 82.5 91.7 86.2 94.7 93.4 86.0 83.3 74.0 不合格
两种结果 的差值
-2.1 1.1 3.9 8.8 -3.2 2.0 -4.5 -1.5 -1.3 -0.9 5.7
理材料:取15~20株叶片，剪碎放入植物组织破碎仪(德国 RETSCH GM200)研磨罐研磨成浆，取出100mg放入EP管。 对于种子，可以取10g放入植物组织破碎仪研磨罐研磨成 粉状，取出20mg放入EP管。2.向EP管中加入400μL缓冲 液LP1和6μL RNaseA(10mg/ml)，涡旋振荡1min，室温放 置10min。3.加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡 1min。4. 1.2万rpm离心5min，将上清移至新的离心管。5.加 入1.5倍体积(一般为600μL)的缓冲液LP3(例如500μL的滤液 加750μL缓冲液LP3)，立即充分振荡混匀15s。6.将上一步 所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱(CB3)中(吸附柱放入 收集管中)，1.2万rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入 收集管中。7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，1.2万 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。如 果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱CB3中加入500μL无水乙 醇，1.2万rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集 管中。8.重复操作步骤7。9. 将吸附柱CB3放入收集管中， 1.2万rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置 数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。10.吸附 柱CB3转入一个干净的编了号的离心管中，向吸附膜的中 间部位悬空滴加150μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min， 1.2万rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。 1.2.3 SSR分析
号 编号 鉴定结果
鉴定结果
备注
1 015 真实性不合格
田间无对照
2 016 真实性不合格
田间无对照
3 057 真实性不合格 性状不典型
4 059 真实性不合格 性状不典型
5 069 真实性不合格 性状不典型
6 071 真实性不合格 性状不典型
7 095 真实性不合格
田间无对照
8 122 真实性不合格 性状不典型
实验材料一由安徽省种子质量监督检验站种在安徽省 合肥市安徽种子管理总站鉴定基地，每个小区鉴定1 000 株；实验材料二种植在四川省农业厅双流九江镇良种实验 基地，相同品种及相近品种与对照相邻种植，每个样品种 植250株，一次重复。田间鉴定在植株特征特性表现敏感 期，请持证田间检验员和育种家进行品种真实性鉴定，鉴 定依据《农作物种子检验规程》（GB/T3543.5-1995）规 定方法执行，性状判定按照品种审定性状描述进行，鉴定 植株类型分为正常株、不育株、异型株和感病株，纯度鉴 定以正常株占鉴定总株数的百分率表示。
25 278 真实性不合格 性状不典型
26 280 真实性不合格 性状不典型
27 299
未检测
性状不典型 无标准样品
28 300 真实性不合格
田间无对照
29 301 真实性不合格 性状不典型
30 302 真实性不合格 性状不典型
31 306 真实性不合格 性状不典型
32 309 真实性不合格 性状不典型
9 123 真实性不合格
田间无对照
10 124 真实性不合格 性状不典型
11 127 真实性不合格 性状不典型
12 155 真实性不合格 性状不典型
13 156
未检测
性状不典型 无标准样品
14 179 真实性不合格 性状不典型
15 195 真实性不合格 性状不典型
16 206 真实性不合格 性状不典型
（收稿日期：2013—11—28）
2014 . 3 种子世界 35
科学实验
Scientific Experiment doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.018
杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定
周 会 苏 秀 毛双林 吕季娟
（四川省种子站 成都 610041）
本研究以459份杂交水稻为研究材料，分别用SSR 分子标记、田间小区品种纯度正季鉴定法鉴定杂交水稻 品种真实性和纯度，以田间小区品种纯度鉴定结果为对 照，比较SSR分子标记鉴定方法的准确度。研究结果表 明，SSR标记法与田间正季鉴定结果基本一致，两种鉴 定方法的真实性鉴定结果完全一致，两种鉴定方法的纯 度值最大相差8.8%，平均差距为0.7%。实验结果表明 SSR分子标记法能准确、快速地鉴定杂交水稻品种真实 性和纯度。
SSR引物来自中华人民共和国农业行业标准NY/ T1433-2007上公布的引物序列，并由上海英骏生物技术有 限公司合成。PCR反应体积为10µL，其中含模板1.0µL (浓 度为50ng/µL)，2*Taq PCR MasterMix 6.0µL(天根生化科技， 北京), 正反向引物各0.5µL(50ng/µL)。PCR反应条件为94℃变 性4min，94℃变性30s，56℃ 退火30s，72℃延伸1min，34 个循环，再72℃延伸7min，12℃保存。PCR扩增完成后， 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染后观察统计带型。 1.2.4 田间种植鉴定
33 311 真实性不合格 性状不典型
34 350
未检测
性状不典型 无标准样品
35 359 真实性不合格 性状不典型
36 362
未检测
性状不典型 无标准样品
37 363
未检测
性状不典型 无标准样品
38 365
未检测
性状不典型 无标准样品
39 366
未检测
性状不典型 无标准样品
40 367
未检测
性状不典型 无标准样品
17 216 真实性不合格 性状不典型
18 217 真实性不合格 性状不典型
19 219 真实性不合格 性状不典型
20 227 真实性不合格 性状不典型
21 248 真实性不合格 性状不典型
22 269 真实性不合格 性状不典型
23 270 真实性不合格
田间无对照
24 271 真实性不合格 性状不典型
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料均为杂交水稻种子，共459份样品。其中材 料一11份，为一般委托鉴定样品；材料二448份，由全国 农技推广中心提供的市场抽检样品。 1.2 方法
1.2.1 发芽
发芽按照《农作物种子检验规程》(GB/T3543.4—1995) 要求，每个样品随机取220粒种子，均匀置于发芽床上，温 度为30℃、光照为750Lx、湿度为75%的条件下发芽7~10d。 1.2.2 DNA提取
41 368
未检测
性状不典型 无标准样品
42 377
未检测
性状不典型 无标准样品
43 379 真实性不合格 性状不典型
44 415 真实性不合格 性状不典型
46 417
未检测
性状不典型 无标准样品
47 419
未检测
性状不典型 无标准样品
48 425
未检测
性状不典型 无标准样品
纯度鉴定实验材料总DNA的提取采用单株快速提取 法，取正常发芽的192颗水稻幼苗，剪取中间粗壮部分 1~2cm，用镊子放入96孔PCR板的孔中，每孔加入40µL 0.25mol/L NaOH，在沸水中煮30s，然后加入40µL DNA 0.25mol/L HCL，20 µL 0.25mol/L Tris(pH8.0，含有体积 分数为0.5%的IGEPAL-CA630)的混合液，在沸水中煮沸 2min，取1µL进行PCR扩增。
用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433-2007中公 布的24对引物，以农业部提供的标准样品作为对照，对448 份样品进行品种真实性鉴定，通过6%非变性聚丙烯酰胺进 行电泳，共检测出37份样品真实性不合格(表2)。将SSR分 子标记鉴定结果与田间品种真实性鉴定结果进行比较，有 13个样品没有标准样品，未做SSR鉴定外，有6个样品田间 没有对照样品，未进行田间鉴定，其余429个样品鉴定结果 与田间鉴定结果一致，这充分说明利用SSR分子标记技术 鉴定品种真实性和纯度，其结果可靠、准确。
3 讨论与结论
我国已加入WTO，经济的发展不仅需要健全良好的市 场环境秩序，而且需要消除技术壁垒，实现与国际的顺利接 轨。水稻是我国的主要粮食作物，播种面积大，为了适应经 济发展新形势，杂交水稻研究与开发中的知识产权保护工作 尤显重要。为此，加强与改进品种鉴定工作是形势所需。把 先进的DNA分子标记技术应用于杂交水稻品种真实性和纯度 鉴定，并使其标准化，这不仅可以防止假冒种子充斥市场， 而且将为中国杂交水稻在走向世界的进程中，维护其在国际 市场上的权威性提供重要的保障。
2 结果与分析
用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433-2007中 公布的24对引物，对实验材料一中11份样品进行PCR扩
34 种子世界 2014 . 3
科学实验
Scientific Experiment
表2 品种真实性SSR分子标记鉴定与田间小区种植鉴定结果比较
序 样品 SSR分子标记 田间种植
49 445 真实性不合格 性状不典型
50 448 真实性不合格 性状不典型
增，通过6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果，谱带中 出现双亲互补带型的为杂交种，母本纯合带型推测为育性 恢复的不育系，其他带型推测为其他杂株，以此计算纯度 的百分率。SSR分子标记鉴定结果与田间小区种植鉴定结果 比较显示(表1)，两种鉴定结果都低于国家质量标准，判定 为不合格。SSR分子鉴定结果略低于田间小区种植鉴定结 果，前者鉴定结果平均值为86.6%，后者鉴定结果平均值为 87.3%，两者相差0.7%。纯度值差异最大为4号样品，相差 8.8%，差异最小为9号样品，仅差0.9%。
目前，在海南进行异地异季小区种植鉴定是我国杂 交水稻品种纯度和真实性鉴定的主要手段之一。但海南异 地异季鉴定的光照气候条件与正季种植光照气候条件的差 异，导致植株的性状表现有差异，这要求鉴定人员要对鉴 定样品的特征特性非常熟悉，且田间小区种植鉴定时间 长、费用高。相对田间小区种植鉴定，SSR 标记鉴定杂交 水稻品种纯度和真实性具有快速、便捷、费用低等优势， 非常适合我国目前种子公司应用要求。
真实性鉴定样品种子总DNA提取，采用植物基因组 DNA提取试剂盒(天根生化科技，北京)，具体方法为：1.处
表1 田间小区种植鉴定与SSR分子标记鉴定结果比较
样品 编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 判定结果
田间检 测值 87.9 90.8 85.0 91.3 88.5 88.2 90.2 91.9 84.7 82.4 79.7 不合格
由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基 因间差异很大。因此，这一技术很快便发展为一种分子标 记。在各种DNA分子标记中，SSR标记应用于杂交种的鉴定 和纯度检测，具有很大的优越性。首先，SSR标记的引物是 根据重复序列两端相对保守的单拷贝序列设计，其扩增产 物稳定，建立的指纹图谱可靠。其次，SSR作为共显性标 记，比显性标记提供更多的信息，而且SSR位点具有复等位 性，可在种内的栽培品种之间获得多态性标记位点。
分子 检测值
90.0 89.7 81.1 82.5 91.7 86.2 94.7 93.4 86.0 83.3 74.0 不合格
两种结果 的差值
-2.1 1.1 3.9 8.8 -3.2 2.0 -4.5 -1.5 -1.3 -0.9 5.7
理材料:取15~20株叶片，剪碎放入植物组织破碎仪(德国 RETSCH GM200)研磨罐研磨成浆，取出100mg放入EP管。 对于种子，可以取10g放入植物组织破碎仪研磨罐研磨成 粉状，取出20mg放入EP管。2.向EP管中加入400μL缓冲 液LP1和6μL RNaseA(10mg/ml)，涡旋振荡1min，室温放 置10min。3.加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡 1min。4. 1.2万rpm离心5min，将上清移至新的离心管。5.加 入1.5倍体积(一般为600μL)的缓冲液LP3(例如500μL的滤液 加750μL缓冲液LP3)，立即充分振荡混匀15s。6.将上一步 所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱(CB3)中(吸附柱放入 收集管中)，1.2万rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入 收集管中。7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，1.2万 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。如 果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱CB3中加入500μL无水乙 醇，1.2万rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集 管中。8.重复操作步骤7。9. 将吸附柱CB3放入收集管中， 1.2万rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置 数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。10.吸附 柱CB3转入一个干净的编了号的离心管中，向吸附膜的中 间部位悬空滴加150μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min， 1.2万rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。 1.2.3 SSR分析
号 编号 鉴定结果
鉴定结果
备注
1 015 真实性不合格
田间无对照
2 016 真实性不合格
田间无对照
3 057 真实性不合格 性状不典型
4 059 真实性不合格 性状不典型
5 069 真实性不合格 性状不典型
6 071 真实性不合格 性状不典型
7 095 真实性不合格
田间无对照
8 122 真实性不合格 性状不典型
实验材料一由安徽省种子质量监督检验站种在安徽省 合肥市安徽种子管理总站鉴定基地，每个小区鉴定1 000 株；实验材料二种植在四川省农业厅双流九江镇良种实验 基地，相同品种及相近品种与对照相邻种植，每个样品种 植250株，一次重复。田间鉴定在植株特征特性表现敏感 期，请持证田间检验员和育种家进行品种真实性鉴定，鉴 定依据《农作物种子检验规程》（GB/T3543.5-1995）规 定方法执行，性状判定按照品种审定性状描述进行，鉴定 植株类型分为正常株、不育株、异型株和感病株，纯度鉴 定以正常株占鉴定总株数的百分率表示。
25 278 真实性不合格 性状不典型
26 280 真实性不合格 性状不典型
27 299
未检测
性状不典型 无标准样品
28 300 真实性不合格
田间无对照
29 301 真实性不合格 性状不典型
30 302 真实性不合格 性状不典型
31 306 真实性不合格 性状不典型
32 309 真实性不合格 性状不典型
9 123 真实性不合格
田间无对照
10 124 真实性不合格 性状不典型
11 127 真实性不合格 性状不典型
12 155 真实性不合格 性状不典型
13 156
未检测
性状不典型 无标准样品
14 179 真实性不合格 性状不典型
15 195 真实性不合格 性状不典型
16 206 真实性不合格 性状不典型
（收稿日期：2013—11—28）
2014 . 3 种子世界 35
科学实验
Scientific Experiment doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.018
杂交水稻品种真实性和纯度的SSR分子标记鉴定
周 会 苏 秀 毛双林 吕季娟
（四川省种子站 成都 610041）
本研究以459份杂交水稻为研究材料，分别用SSR 分子标记、田间小区品种纯度正季鉴定法鉴定杂交水稻 品种真实性和纯度，以田间小区品种纯度鉴定结果为对 照，比较SSR分子标记鉴定方法的准确度。研究结果表 明，SSR标记法与田间正季鉴定结果基本一致，两种鉴 定方法的真实性鉴定结果完全一致，两种鉴定方法的纯 度值最大相差8.8%，平均差距为0.7%。实验结果表明 SSR分子标记法能准确、快速地鉴定杂交水稻品种真实 性和纯度。