第五章 酶的化学修饰

X-Y
剂
Y
食品与生物工程学院 张海晖
3.蛋白质工程 3.蛋白质工程
将酶相应的cDNA定点突变， 将酶相应的cDNA定点突变， cDNA定点突变 突变的cDNA只表达一个或几个氨 突变的cDNA只表达一个或几个氨 cDNA 基酸被置换的酶蛋白， 基酸被置换的酶蛋白，测定其活 性可知被置换的氨基酸是否为活 力所必需。 力所必需。
用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一 氨基酸残基的侧链基团。 氨基酸残基的侧链基团。
3)亲和标记（位点专一性修饰） 3)亲和标记（位点专一性修饰） 亲和标记
采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制： 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶 加以修饰标记。 加以修饰标记。
食品与生物工程学院 张海晖
第二节 酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因 1.限制酶大规模应用的原因 1)细胞外稳定性差； 1)细胞外稳定性差； 细胞外稳定性差 2)酶活性不够高； 2)酶活性不够高； 酶活性不够高 3)具有抗原性。 3)具有抗原性。 具有抗原性
食品与生物工程学院 张海晖
第五章 酶分子的化学修饰
• 酶的活性中心 • 酶化学修饰的目的 • 酶化学修饰的原理 • 酶化学修饰的设计 • 酶化学修饰的应用
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心的重要化学基团
7种氨基酸出现的频率最高
Lys Asp Glu Cys His 兰天果拌猪肉丝） （兰天果拌猪肉丝） Tyr Ser
某些功能基团, 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 氨基、羧基、巯基、 和咪唑基）是酶的必需基团。 和咪唑基）是酶的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
修饰剂： 2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 ）、右旋糖酐 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll） ）、蔗糖聚合物 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下 修饰方法：修饰前活化， 与酶分子共价结合。 与酶分子共价结合。
食品与生物工程学院 张海晖
三、研究酶活性中心的方法
1.物理学方法 1.物理学方法 用X射线衍射法直接检测底物或其 类似物与酶形成的中间复合物（包括酶 类似物与酶形成的中间复合物（ 和底物）的相对位置。 和底物）的相对位置。
食品与生物工程学院 张海晖
2.化学修饰法 2.化学修饰法
1)非专一性化学修饰 1)非专一性化学修饰
食品与生物工程学院 张海晖
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。 50年代末） 年代末 人为改变天然酶的某些性质， 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。 70年代末之后） 范围。（70年代末之后） 年代末之后 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 产生新的催化能力。
食品与生物工程学院 张海晖
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白 水解酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分 子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
食品与生物工程学院 张海晖
活性中心基团的鉴定标准
失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 可逆抑制剂有保护作用 活性中心）。 有保护作用（ ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 先加S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 除去S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 活性不丧失 透析
2. 改变酶特性有两种主要的方法
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的 天然酶的活性。 天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因 而达到改造酶的目的。 而达到改造酶的目的。
食品与生物工程学院 张海晖
赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
食品与生物工程学Fra Baidu bibliotek 张海晖
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（ 2%）。 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 活性部位只占酶分子很小的一部分 (2)活性部位是一个三维实体。 (2)活性部位是一个三维实体。 活性部位是一个三维实体 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 活性中心构象不是固定不变的 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用 (5)酶与底物通过盐键、氢键、 酶与底物通过盐键 等次级键结合。 等次级键结合。
要注意—— 三、反应条件的选择 要注意 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与 反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与
条件
1. 酶与修饰剂的分子比例 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间
食品与生物工程学院 张海晖
第五节 酶化学修饰的种类及应用
食品与生物工程学院 张海晖
差别标记： 差别标记：
化学修饰 底物或抑制剂存在 含同位素标记 去除底物或抑制剂 的同样试剂 原来被保护的基团带同位素标记 活性基团不与修饰剂作用
可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。
食品与生物工程学院 张海晖
2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 专一性化学修饰
酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂 敏感基团交联上修饰剂后 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋 白水解酶破坏的可能性。 白水解酶破坏的可能性。
食品与生物工程学院 张海晖
如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇与修饰剂共价结合 抗原决定簇与修饰剂共价结合。 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇与修饰剂共价结合。
3. 酶化学修饰（chemical
modification） modification）
（1）酶的化学修饰
通过化学基团的引入或除去， 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发 生改变。 生改变。
酶选择性化学修饰： （2）酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
食品与生物工程学院 张海晖
Y
结构相似， ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 结构相似 亲和力大， 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 残基亲和力小。
亲 和
Y
X
Y
修
Y
饰
②具有活泼的化学基团（如卤素）可 具有活泼的化学基团（如卤素） 与活性中心的基团形成稳定的共价键。 与活性中心的基团形成稳定的共价键。
食品与生物工程学院 张海晖
第三节 酶化学修饰的原理
如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团， 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。
如何保护酶活性部位与抗抑制剂 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后， 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或 静电斥力阻挡抑制剂， 遮盖”了酶的活性部位。 静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 破坏了抗原决定簇 抗原性降低乃至消除 阻碍抗原、 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 遮盖”了抗原决定簇 阻碍抗原
2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体， 2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成 大分子修饰剂本身是多聚电荷体 “缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部 缓冲外壳” 抵御外界环境的极性变化， 位微环境相对稳定。 位微环境相对稳定。
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团修后： 若某基团修后：
(1)酶活性不变 (1)酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性不变 该基团可能不是酶的必需基团 (2)酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团, (2)酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团,但 酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团 同活性中心内的必需基团结合 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。 不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。
食品与生物工程学院 张海晖
第四节 酶化学修饰的设计
包括酶的—— 一、充分认识酶分子的特性 包括酶的 1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
食品与生物工程学院 张海晖
二、 修饰剂的选择
要考虑—— 要考虑
1.修饰剂的分子量及链的长度（ 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子 修饰剂的分子量及链的长度 量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（ 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的 修饰剂上反应基团的数目及位置
食品与生物工程学院 张海晖
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。 根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4 种氨基酸可分成
1. 非极性R基氨基酸（共8种）： 非极性R基氨基酸（
丙氨酸(Alanine,Ala,A), 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P) 脯氨酸(Proline,Pro,P)
一、酶的表面化学修饰
（一）大分子修饰（大分子结合修饰） 大分子修饰（大分子结合修饰）
是目前应用最广的酶分子修饰方法。 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合 水溶性大分子与酶结合， 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间 定义 结构发生某些精细的改变， 结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功 能的方法。 能的方法。
食品与生物工程学院 张海晖
酶蛋白侧链基团修饰） （二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特 定义： 定义 定的功能基团发生化学反应。 定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 侧链基团 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 侧链基团修饰剂 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被 种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸 修饰，它们一般具有亲核性。 修饰，它们一般具有亲核性。
食品与生物工程学院 张海晖
应用： 3. 应用：
如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如： Dextran修饰α 淀粉酶， β－淀粉酶， 又如：用Dextran修饰α-淀粉酶， β－淀粉酶，胰蛋白 修饰 酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。 过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。