溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良

作为一种糖苷水解酶的溶菌酶，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液(如淋巴液)、组织(如肝)、肾细胞内等[1]。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。

溶菌酶对人体无毒副作用，是一种安全的天然防腐剂，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。

可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等[2]。

作为碱性酶的溶菌酶，其来源不同，水解细胞壁的性能也表现为较大差异[3]。

溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖，作用位点是NAM与NAG碳原子间的β-1.4糖苷键[4]。

肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架)，是NAG 与NAM 通过 β-1，4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。

肽聚糖结构中的任何化学键断裂，都能促使细胞壁中的肽聚糖分解，导致细菌细胞壁被破坏，从而体现溶菌酶的溶菌特性[6]。

近年来，根据不同原料及溶菌酶的特性，提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。

结晶法这一传统的方法，是由 Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶[7]。

本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料，采用结晶法提取分离溶菌酶，进而利用重结晶的方法反复精制，可提取到所需纯度的溶菌酶晶体[8]。

1　实验1.1　主要仪器、试剂与材料1.1.1 主要仪器UV-29200 紫外可见分光光度计；JJ-a 数控恒温磁力搅拌器；M304781 离心机；DSX-280B蒸气压力灭菌锅；KYC-111 摇床；SW-CJ-2F 超净工作台；FD-1B-50 冷冻干燥机；2X-15D 旋片式真空泵；R201 旋转蒸发仪；Sorvalls Upert-21 高速离心机；YP-5002 电子天平。

1.1.2 主要试剂R-250、G-250考马斯亮蓝；NaH2PO4；Na2HPO4；1mol/L NaOH；20000 u/mg溶菌酶标准液；3g/L牛肉膏；营养肉汤；10g/L胰蛋白陈；微球菌；5.1%的 NaCl溶液；HCl；CH3COOH；琼脂。

1.1.3 主要材料新鲜湖光岩鹌鹑蛋，购置于湖光岩农贸市场。

1.2　实验方法溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨黄赞良，谈海玉，邓彩思，张兆霞*，李　泳*（广东海洋大学，广东 湛江 524088）摘　要：以湖光岩鹌鹑蛋为原料，采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。

探讨不同条件对溶菌酶收率及活性的影响，确定溶菌酶最佳的分离提取条件：盐析NaCl质量分数为5.1%，pH=10.7，盐析时间为120h，收率达到 0.378%，酶活力达到 13700 U/mg。

关键词：盐析法；溶菌酶；酶活力中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2017）05-083-04_________________________收稿日期：2017-04-25基金项目：广东海洋大学团队项目（项目编号：C13435）, 大学生创新创业项目（项目编号：CXXL2016152）。

作者简介：黄赞良，广东海洋大学，制药工程专业，大学生。

*通讯作者：张兆霞，李泳，广东海洋大学教师，从事生物酶相关方面的科研工作。

云南化工2017年第5期·84·1.2.1 溶菌酶的提取1）将新鲜鹌鹑蛋洗净晾干、用无菌注射器收集鹌鹑蛋清液并搅拌均匀后，用纱布过滤去除蛋清中的卵带备用。

2）取一定量蛋清液，加入适量NaCl后搅拌均匀，用1M的NaOH溶液调节蛋清液，使pH=10.7左右，投入适量溶菌酶晶种后，放置于4℃环境大约5d，待析出溶菌酶晶体后，冷冻干燥得干粉溶菌酶。

1.2.2 溶菌酶底物的制备1）培养基的配制取5g NaCl，3.0g牛肉浸取物，10.0g蛋白胨，放置于1 L 蒸馏水中溶解，加入2%的琼脂液，用酸碱液调节pH为7.0，用三角瓶分装成斜面，在120℃的水蒸气条件下灭菌20min后备用。

2）底物的制备用0.5mL的无菌水振荡溶解冻干溶壁微球菌，并将菌体接种于培养基斜面中，于25℃培养 2 d，备用（如果需要，可再次接种扩培）。

用无菌水洗涤菌体，5000r/min 离心15min，收集沉淀菌体，反复洗涤至无蛋白(以考马斯亮蓝R250蛋白质显色法[9]检测)，冷冻干燥得干粉菌体。

用0.5g干粉菌体和适量的0.1mol/L、pH=6.2的磷酸缓冲溶液，于玛瑙研钵中研磨 5min后，稀释至 30~40mL 备用。

1.2.3 溶菌酶活力的测定1）酶液的制备：以0.1% 的氯化钠溶液作为激活剂，称5mg干粉溶菌酶与0.1mol/L、pH=6.2 的磷酸缓冲液溶配制成5.0×10-2mg/mL的溶菌酶溶液。

2）1个酶活力单位：在1min、pH= 6.2的条件下，使溶菌酶溶液OD450值降低1×10-3个单位定义为1个酶活力单位。

以标准溶菌酶的检测条件为固定的标准测定条件。

酶活力单位计算公式：在光密度OD450为 0.5~0.6 的范围内，酶活力单位(U/mg) = (OD t=0-OD t=60)/样品的质量(mg)×10003）酶活力的测定。

将底物液与溶菌酶溶液分别于常温水浴中保温10min，测量底物液的OD450值作为空白值，接着加入0.2mL溶菌酶溶液迅速摇匀，并开始记时，每隔1min 测1 次OD450值。

2　结果与讨论2.1　盐析时间对溶菌酶活性的影响由于溶菌酶处于盐析条件下，其活性随时间而减退，所以确定适当的盐析时间是十分重要的。

在盐析实验过程中，每隔20h取样一次，并测定鹌鹑蛋清的比酶活，结果见图1。

图1　盐析时间对溶菌酶收率的影响由图1知，在盐析20h时，酶活力测定最高为16100 U/mg，随着盐析时间的增加，酶活力逐步下降，在盐析120h时，酶活力为13700 U/mg，此后，酶活力迅速下降。

说明随盐析时间增加，酶活力逐渐下降。

2.2　pH 值对溶菌酶活性的影响每隔0.5个pH 值单位取一次溶菌酶溶液，并测定比酶活，结果见图2。

图2　pH 值对溶菌酶活性的影响由图2知，溶菌酶在pH=6.5时酶活力最高，为13700U/mg，升高或降低溶菌酶溶液的pH值，酶活力都将迅速下降。

2017年第5期·85·黄赞良等：溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨2.3　温度对溶菌酶活性的影响改变溶菌酶溶液的温度，每隔10℃ 取样一次，并测定其溶液的比酶活，结果见图3。

图3　温度对溶菌酶活性的影响由图3可见，在20~90℃的范围内，溶菌酶活性于50℃ 时最高，为13700 U/mg。

2.4　盐析时间对溶菌酶收率的影响在盐析过程中，每隔20h，测定一次溶菌酶的收率，结果见图4。

图4　盐析时间对溶菌酶收率的影响由图4 可见，溶菌酶的收率在0~120h的盐析时间内是逐渐增加的，且盐析达到120h时，酶的收率最高。

当盐析超过120h后，酶的收率则有些下降。

所以，鹌鹑蛋溶菌酶的盐析时间应不小于120h。

2.5　pH 值对溶菌酶收率的影响选用不同PH值条件下，提取分离溶菌酶，每隔0.5个pH 值单位，测定一次溶菌酶的收率，结果见图5。

图5　pH 值对溶菌酶收率的影响由图5可知，pH 值介于9.0~10.7范围内，溶菌酶的收率随pH的升高而逐步增大，当pH = 10.7 时，溶菌酶的收率达到最高。

当pH值超过10.7时，随着pH 值的增加，溶菌酶的收率又迅速降低，所以，溶菌酶的盐析pH 值应在10.7左右。

2.6　NaCl的质量分数对溶菌酶收率的影响选用不同NaCl的质量分数，盐析分离溶菌酶，每隔0.5个质量分数单位，测定一次溶菌酶的收率，结果见图6。

图6　NaCl的质量分数对溶菌酶收率的影响由图6可知，NaCl质量分数介于3.0%~5.1%范围内，随质量分数的升高溶菌酶的收率逐步提高，当NaCl质量分数达到5.1%时，溶菌酶的收率最高。

随着NaCl质量分数继续增大，溶菌酶的收率反而逐步下降，所以，溶菌酶的盐析NaCl质量分数应在5.1左右。

3　结论采用NaCl作为盐析剂，于等电点分离并结晶云南化工2017年第5期·86·溶菌酶。

得出提取分离鹌鹑蛋溶菌酶最佳条件：盐析用5.1% 的NaCl溶液的质量分数、10.7的pH、120h的盐析时间。

获得溶菌酶活力最高达13700 U/mg，溶菌酶的收率为0.378%。

溶菌酶在工农业生产中应用广泛，溶菌酶因来源不同，所得分子量、结构及性质等会有所不同，因而，应根据具体提取物质，来制定不同的分离工艺路线。

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