Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
Ion torrent技术
Ion Torrent 技术Ion Torrent已经发布了一个商业化的仪器——1个新的半导体芯片——直接将化学信号转换成数字信号。
该仪器的第一个技术应用就是进行DNA测序。
该仪器充分利用了几十年的半导体研究成果，在短短几年内就给整个的工业设计、制造和供应链基础设施带引入——1万亿美元的投资空间——迎接测序的挑战。
该挑战带来的结果就是Ion半导体测序，第一个不需要光学系统的商业测序仪，且提供了一个前所未有的测序速度，扩增规模和低成本。
该技术在几个月内将测序规模从第一代含有一百多万个微传感器的Ion 314芯片扩展到七百多万个微传感器的二代Ion 316芯片——所有的运行时间都保持在1到2个小时之内（图1）。
该测序的化学反应非常简单。
一般地，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA 分子中就会释放出一个质子，导致局部可被检测的pH值变化。
每个Ion Torrent 半导体微孔测序芯片中含有将近一百多万个DNA分子拷贝。
Ion PGM测序仪按照一个核苷酸接一个核苷酸的微芯片流测序。
在一个特定的微孔中，如果模板DNA分子上的一个互补的核苷酸被合成，微孔就会释放出一个氢离子。
然后溶液的pH值改变并被离子传感器检测到，基本上直接将该化学信号转变为数字信号。
如果DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。
如果模板上的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。
因该法是直接检测DNA 合成，不需要扫描，摄像机，荧光等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。
工作流程Ion Torrent个人基因组测序仪的操作流程非常简单。
第一步是产生两端有Ion Torrent接头的测序DNA片段的文库。
这一步可以通过直接将接头固定在PCR 产上或者在设计PCR引物的时候直接在引物的5’端加上Ion的接头序列来实现。
然后，文库的片段被克隆到专门的离子微球颗粒上，再通过微乳液PCR进行扩增。
利用生物大数据技术进行基因组重测序分析的步骤
利用生物大数据技术进行基因组重测序分析的步骤基因组重测序分析是一种通过检测DNA序列来研究生物基因组的技术。
近年来，随着生物大数据技术的进步，基因组重测序分析已经成为研究生物多样性和进化的重要手段。
在本文中，我们将探讨利用生物大数据技术进行基因组重测序分析的具体步骤。
第一步：准备样本和测序仪器在进行基因组重测序分析之前，我们首先需要准备样本和测序仪器。
样本可以是任何生物体的DNA，例如细菌、真菌、植物或动物。
而测序仪器可以是Illumina、PacBio或Ion Torrent等商业化的高通量测序仪器。
根据样本的需求和研究目的，选择合适的测序仪器进行测序。
第二步：提取DNA并进行文库构建提取DNA是基因组重测序分析的关键步骤之一。
样本中的DNA需要经过特定的提取方法，例如酚/氯仿方法或商用DNA提取试剂盒，以获得高质量的DNA。
提取的DNA随后需要进行文库构建，即将DNA片段连接到测序适配体上。
文库构建的方法有多种选择，例如Illumina的TruSeq文库构建方法或NEBNext Ultra DNA文库构建方法，根据实验需求选择合适的方法进行文库构建。
第三步：测序数据质量控制在进行基因组重测序之前，我们需要对测序数据的质量进行控制。
质量控制的目的是检查测序数据是否具有良好的准确性和可靠性。
常见的质量控制方法包括使用FastQC软件分析测序数据的质量值、测序错误率和GC含量等信息。
根据质量控制结果，我们可以选择性地去除低质量的测序数据以提高后续分析的准确性。
第四步：测序数据比对测序数据比对是基因组重测序分析的核心步骤之一。
它的目标是将测序数据准确地与参考基因组进行比对，以鉴定基因组的变异位点和基因功能。
比对软件有许多选择，例如BWA、Bowtie2和STAR等。
在比对的过程中，质量控制的结果可以帮助我们在特定的阈值下筛选出可靠的比对结果。
第五步：变异位点检测和注释在比对完成后，我们可以开始进行变异位点的检测和注释。
Ion torrent ChIP-Seq文库构建方法
ChIP-Seq文库构建方法一、样本要求1）浓度≥10ng/μL，总量≥200ng，OD260/280为1.8-2.2，若单次ChIp的量不够，建议将2-3次ChIp的DNA合并在一起2）提供DNA片段大小的凝胶电泳图，要求片段大小不超过400bp3）样品用1.5mL离心管，用Parafilm封口，冰袋保存二、流程ChIP DNA↓Qubit定量↓末端修复↓ChIP DNA片段大小选择及纯化↓加接头、纯化↓文库扩增↓纯化↓文库检测（Qubit定量、Agilent检测）三、步骤1.末端修复对ChIP DNA样品进行Qubit定量检测，将待测DNA浓度稀释为0.2ng/μL 向一支新的1.5mL LoBind管中按顺序加入下列组分ChIP DNA，10ng 50μLNuclease-free Water 29μL5×End Repair Buffer 20μLEnd Repair Enzyme 1μLTotal 100μL室温下放置20分钟2.片段选择末端修复的ChIP DNA采用Agencourt AMPure XP Kit进行两轮片段筛选。
第一轮筛选过程将＞250bp的片段富集到磁珠上，小于250bp的片段留在上清液中。
第二轮筛选使用第一轮的上清液，加入新的磁珠，将100bp以上的片段筛选出来，保留磁珠。
磁珠捕获的DNA片段大小在100-250bp之间，洗脱并富集。
步骤：第一轮筛选1）向ChIP DNA体系中加入150μL无核酸酶水，使总体积为250μL2）向样品中加入225μL Agencourt AMPure XP Reagent，上下颠倒五次混匀，瞬时离心，室温下放置5分钟3）瞬时离心，将离心管放置到磁力架（如DynaMag-2）上3min，至溶液澄清4）小心将上清转移到一支新的1.5mL离心管，留下约20μL于原来的体系中5）装有磁珠的离心管瞬时离心后，放回到磁力架上至溶液澄清，将上清液小心转移到第四步的离心管中，丢弃磁珠第二轮筛选1）向装有第一轮筛选上清液的1.5mL离心管内加入100μL Agencourt AMPure XP Reagent beads，上下颠倒混匀5次，瞬时离心，室温下放置5分钟2）离心管瞬时离心后，放置于磁力架上3min，至溶液澄清，小心除去上清3）离心管保留在磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，在磁力架上颠倒离心管两次使磁珠混合，待上清澄清后，除去上清4）重复步骤3）5）离心管瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上，用20μL枪头小心除去多余的乙醇6）将离心管留在磁力架上，室温下风干不超过5min7）将离心管从磁力架上取下，加入25μL Low TE，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s8）瞬时离心，将离心管放置到磁力架上1分钟，待溶液澄清后，将上清转移至一支新的0.2mL PCR管3.接头连接和纯化3.1 接头连接和缺口修复向0.2mL PCR管中按顺序加入下列物质End-repair ChIP DNA 25μL10×Ligase Buffer 10μLIon P1 Adaptor,1:16 1μLIon Xpress Barcode X+,1:16 1μLdNTP Mix 2μLNuclease-free Water 51μLDNA Ligase 2μLNick Repair Polymerase 8μLTotal 100μL体系按照以下循环进行1轮循环扩增25℃15min72℃5min4℃Hold3.2 纯化1）体系中加入140μL（1.4倍样品体积）Agencourt AMPure XP Reagent，上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上3min至上清澄清，小心除去上清3）离心管保留在磁力架上，加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，在磁力架上颠倒离心管两次，待溶液澄清后，除去上清4）重复步骤3）5）离心管瞬时离心后，将离心管放置到磁力架上，用20μL枪头小心除去多余的乙醇6）将离心管留在磁力架上，室温下风干不超过5min7）将离心管从磁力架上取下，加入25μL Low TE，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s8）瞬时离心，将离心管放置到磁力架上1分钟，待溶液澄清后，将上清转移至一支新的1.5mL PCR管4.文库扩增及纯化4.1 文库扩增向上一步的1.5mL离心管中加入以下物质Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100μLLibrary Amplification Primer Mix 5μLLigated ChIP DNA（unamplified library）25μLTotal 130μL按照一下循环进行10-15轮循环扩增95℃5min95℃15s58℃15s 10-15循环70℃1min4℃hold4.2 扩增产物纯化第一轮纯化（除去250bp以上的片段）使用1.5倍样品体积的Agencourt AMPure XP Reagent步骤：1）向PCR扩增产物中加入195μLAgencourt AMPure XP Reagent（1.5倍样品体积），上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）离心管瞬时离心后，放置到磁力架上3分钟，至澄清，小心除去上清液3）保持离心管于磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，上下颠倒混匀，待澄清后，除去上清液4）重复第三步5）离心管瞬时离心，放回磁力架，待澄清后，用20μL枪头将上清吸去6）保持离心管在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入50μL Low TE缓冲液，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s 8）将离心管放置到磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移到一支新的1.5mL离心管第二轮纯化（回收100-250bp的片段）向体系内加入1.5倍体积的Agencourt AMPure XP Reagent进行二轮纯化1）向PCR扩增产物中加入75μL Agencourt AMPure XP Reagent（1.5倍样品体积），上下颠倒混匀5次，瞬时离心后，室温放置5min2）离心管瞬时离心后，放置到磁力架上3分钟，至澄清，小心除去上清液3）保持离心管于磁力架上，向管内加入500μL新配置的70%乙醇，静置30s，上下颠倒混匀，待澄清后，除去上清液4）重复第三步5）离心管瞬时离心，放回磁力架，待澄清后，用20μL枪头将上清吸去6）保持离心管在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s 8）将离心管放置到磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移到一支新的1.5mL离心管9）将装有DNA的离心管放置到磁力架上，保持1分钟，将上清转移至另一支新的1.5mL离心管5.文库片段检测及定量采用Agilent Test以及Qubit Qualify片段大小在100-400bp，片段浓度不低于1μL/mL需要用到的试剂盒：Ion Plus Fragment KitIon Xpress Barcode Adapters 1-16 Agencourt AMPure XP Kit DynaMag-2磁力架。
全基因组测序实验流程
全基因组测序实验流程英文回答：Genome sequencing is a powerful technique used to determine the complete DNA sequence of an organism's genome. It provides valuable information about the genetic makeupof an individual or a species, allowing researchers tostudy the structure and function of genes, identifydisease-causing mutations, and understand evolutionary relationships.The process of whole-genome sequencing involves several steps. First, DNA samples are obtained from the organism of interest. These samples can be collected from blood, saliva, or tissue samples. Next, the DNA is extracted and purifiedto remove any contaminants. This ensures that the sequenced DNA is of high quality and free from interference.Once the DNA is purified, it is fragmented into smaller pieces. This can be done using physical methods, such assonication, or enzymatic methods, such as restriction digestion. The resulting DNA fragments are then ligatedwith adapters, which allow for the attachment of sequencing primers.The prepared DNA fragments are then amplified using a process called polymerase chain reaction (PCR), which produces multiple copies of the DNA fragments. This step is necessary to ensure that there is enough DNA for sequencing.The next step is sequencing the DNA fragments. Thereare several sequencing technologies available, including Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS). Sanger sequencing, also known as capillary electrophoresis sequencing, was the first method developed for DNA sequencing. It involves the use of fluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.NGS technologies, such as Illumina sequencing andPacific Biosciences sequencing, have revolutionized thefield of genomics. These methods allow for the simultaneous sequencing of millions of DNA fragments, resulting in amuch faster and more cost-effective process.After sequencing, the raw data is generated in the form of short DNA sequences called reads. These reads are then aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the complete genome sequence. This step requires advanced bioinformatics tools and algorithms to accurately assemble the reads.Finally, the assembled genome sequence is analyzed to identify genes, regulatory elements, and other functional elements. This can involve comparing the genome sequence to known databases, predicting gene coding regions, and studying the genetic variation within the genome.中文回答：全基因组测序是一种强大的技术，用于确定生物体基因组的完整DNA序列。
Iontorrent微生物全基因组重测序文库构建实验方案
“Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案”清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在略显拥挤的操作台上，我的思绪开始像电流一样流转，10年的方案写作经验让我对每一个细节都了如指掌。
就让我们一起探索这个关于Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建的实验方案吧。
我们要明确实验的目的：通过Iontorrent平台，对微生物（细菌）进行全基因组重测序，以获取更准确、更全面的基因组信息。
那么，就是具体的步骤了。
一、实验材料与仪器1.材料：微生物（细菌）样本、DNA提取试剂盒、磁珠、PCR试剂、测序试剂盒等。
2.仪器：Iontorrent测序仪、离心机、PCR仪、磁珠分离器、凝胶成像仪等。
二、实验步骤1.样本处理：将微生物（细菌）样本进行适当的预处理，如离心、洗涤等，确保样品的纯净度。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取微生物（细菌）的基因组DNA。
3.DNA定量：利用纳米滴技术或紫外可见分光光度计，对提取的DNA进行定量，以确保DNA的浓度和纯度。
4.DNA片段化：将提取的DNA进行片段化处理，使其成为适合测序的片段大小。
5.文库构建：将片段化的DNA与测序适配器连接，通过PCR扩增，构建测序文库。
6.文库质检：利用凝胶成像仪，对构建的文库进行质检，确保文库的质量。
7.测序：将质检合格的文库上机测序，使用Iontorrent测序仪进行测序。
8.数据分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等分析，得到微生物（细菌）的全基因组序列。
9.结果验证：对测序结果进行验证，如通过PCR、一代测序等方法，确保测序结果的准确性。
三、注意事项1.实验过程中，要注意无菌操作，避免样本污染。
2.操作过程中，要严格按照说明书进行，确保实验的准确性。
3.测序数据的质量控制和分析是关键步骤，要密切关注每个环节，确保结果的可靠性。
4.实验过程中，要随时记录实验数据和操作过程，以便后续的数据整理和分析。
二代测序实验方案和应用
这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。
随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。
这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：全基因组从头测序或者重测序目标序列重测序转录组分析微生物组研究基因调控研究NGS序歹y二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。
从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。
台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR —样，自己进行测序。
这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。
目前，这些仪器的通量在10 Mb到Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。
高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。
一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。
与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp ），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。
还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。
因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。
有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。
这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。
这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。
DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：DNA样本制备文库构建和验证文库分子大规模平行克隆扩增测序二代测序DNA羊本的质量控制首先，评价基因组DNA勺质量是非常必要的（完整性和纯度）。
ion torrent测序原理
ion torrent测序原理
Ion Torrent测序技术基于单核苷酸添加和释放（Single-
nucleotide addition and release）的原理。
该技术通过在DNA模板与
合适的引物、荧光标记和离子检测器中进行PCR扩增和DNA合成，在合成
一条长串DNA的同时检测出每一位碱基的序列信息。
具体步骤如下：
1.准备DNA样本并将其断裂成片段。
2.将DNA片段通过PCR扩增形成一个DNA模板，该模板上的DNA每一
位碱基上需要配对一个反向互补的引物。
3.将模板置于一台Ion Torrent测序器中，在模板上添加一种特殊的
试剂，这种试剂含有一种核苷酸，并且只允许在特定碱基上添加一个碱基。
当这个碱基添加到模板上之后，会释放出一个氢离子并造成一个微弱的电
位变化。
4.通过控制微小的电位变化，Ion Torrent测序器可以检测出新添加
的碱基的种类和位置，也就是测序结果。
一旦这个新碱基被检测出来，就
将它们切割掉，并继续在该位点上重复此过程，直到测序完成。
5.利用计算机对这串测序结果进行分析，并将它们与已知的基因组序
列进行比较，以确定DNA中任何变异或SNP的存在。
全基因组重测序原理
全基因组重测序原理
全基因组重测序是一种通过高通量测序技术对一个个体的完整基因组进行全面测序的方法。
它可以揭示个体的所有基因组变异，包括单核苷酸多态性（SNPs）、插入缺失（Indels）、结构变异和基因组重排等。
全基因组重测序的原理基于高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，通过将DNA样本分离成小片段，然后使用测序仪对这些片段进行测序，最终将这些片段拼接成完整的基因组序列。
在全基因组重测序中，首先需要提取DNA样本，然后将DNA样本打断成小片段。
接下来，这些小片段会被连接到测序适配器上，并进行PCR扩增，形成一个文库。
随后，这个文库会被加载到测序仪中进行测序，产生大量的短序列读段。
这些读段会被拼接成完整的基因组序列，并且通过与基因组参考序列进行比对，可以识别出个体的基因组变异。
全基因组重测序的原理是基于高通量测序技术的快速、准确和经济的特点，可以实现对个体基因组的全面测序。
它在研究人类遗传学、疾病基因组学、进化生物学等领域具有重要的应用价值，可以为个性化医学、疾病诊断和治疗提供重要的信息。
随着测序技术
的不断发展和成本的不断降低，全基因组重测序将在未来得到更广泛的应用。
Ion-Torrent测序技术详解
• 三、模板富集和测序
• 3.将处• 三、模板富集和测序
• 3.将处Chip adapter
Ion Chip
Ports
Tabs Key corner
Db.根据需要在PCR仪上运行如下程序并选择不同的cycle数
4 minutes for ≤1536 primer pairs per pool; 8 minutes for 1,537–6,144; 16 minutes for 6,145–24,576.二、Amplicon制备流程1.DNA/RNA提取
DNA：m≥400ng;c≥20ng/uL 1.8≤OD260/280≤2.0；
OD260/230≥1.8 RNA: m≥40ug;c≥200ng/uL RIN≥7.0;28S:18S≥1.0 2100图谱基线无上抬；5S峰正常 （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.8）】
a.打断结束后在1.5ml离心管中加入1.5X AMPure XP纯化磁珠，吹 打混匀5次。室温下静置5分钟。
b.将1.5ml离心管放置在磁力架上静置3分钟直至溶液清澈，弃上清 【注意：枪头不要碰到磁珠】
c.加入500ul 70%乙醇以清洗磁珠，弃上清，并重复此步骤一次。 d.确保乙醇完全清除，将1.5ml离心管放置在磁力架上，用20ul移
• 三、模板富集和测序
• 2-3准备chip
④chip wash步骤
a.从loading port加入200ul100%异丙醇，从exit well吸出 多余液体，吸干
b.从loading port加入100ul chip preparation solution，从 exit well吸出多余液体【注意：不要产生气泡，否则重复此步 骤】
全基因组重测序流程
全基因组重测序流程小伙伴们！今天咱们来唠唠全基因组重测序这个事儿的流程。
这流程听起来可能有点复杂，不过只要跟着大概的步骤走，其实也没那么难啦。
首先呢，得有样本的采集呀。
这个样本呢，可以是各种各样的生物组织或者细胞啥的。
但是呢，采集的时候可得小心点儿哦！要保证样本的质量，要是样本质量不好，后面可就麻烦咯。
我觉得在采集样本的时候，最好能多采集一点，以防万一嘛。
当然啦，具体采集多少还得根据实际情况来定。
提取好DNA之后呢，就是要对DNA进行定量和质检啦。
这一步为啥要做呢？就是要看看咱们提取出来的DNA质量咋样，量够不够。
要是DNA的量太少或者质量不好，那后面的测序可就不准确了。
这一步啊，我觉得可以多检查几遍，确保万无一失。
然后就是构建测序文库啦。
这个环节可以根据实际情况自行决定一些参数啥的。
构建文库的过程中呢，要按照试剂盒的说明来操作，不过也不要太死板啦，有时候根据经验稍微调整一下也未尝不可。
小提示：在这一步可别太着急，一步一步稳稳地来很重要哦！再接下来就是测序啦。
测序的仪器有好多不同的类型，要根据自己的需求和预算来选择合适的仪器哦。
这一步就像是把咱们之前准备好的东西交给一个超级精密的机器去解读一样。
测序的时候要注意仪器的参数设置，这个很重要！为什么呢？因为这会直接影响测序的结果呀。
测完序之后呢，就会得到一大堆的数据啦。
这些数据就像是一堆乱麻一样，需要我们去整理和分析。
这个数据分析可不容易呢，不过现在有好多软件可以帮助我们。
我们要从这些数据里找到我们想要的信息，就像在大海里捞针一样。
刚开始看这些数据的时候可能会觉得头大，但是别担心，慢慢研究就会有收获的。
最后呢，就是结果的解读和验证啦。
这一步要特别注意！要把得到的结果和我们之前的预期或者已有的知识进行对比，看看是不是合理。
如果有不合理的地方，可能就需要重新检查前面的步骤啦。
小提示：别忘了最后一步哦！。
全基因组重测序技术在研究微生物物种中的应用
全基因组重测序技术在研究微生物物种中的应用随着科技的不断发展，生物学领域的研究也发生了巨大的变化。
全基因组重测序技术是其中的一个重要工具，它已经在微生物学研究中得到广泛的应用。
全基因组重测序技术可以对微生物物种进行深入的研究，有助于我们深入了解微生物群落的组成、演化和功能。
1. 全基因组重测序技术的原理全基因组重测序技术是一个高通量的DNA测序技术，它可以有效地对DNA序列进行快速、准确和高效的测定。
具体来说，这项技术是通过将微生物DNA分散到许多小碎片，并将这些碎片扩增、序列化和定位回原始位置来实现的。
通过重复这个过程，我们可以构建出完整的基因组序列，从而对微生物物种进行深入的研究和分析。
2. 全基因组重测序技术在微生物学研究中的应用全基因组重测序技术可以解决许多微生物学领域的研究问题。
例如，在微生物的功能研究中，通过全基因组重测序技术可以发现微生物环境中的微生物种类和数量，并确定它们在特定功能的发挥中的作用。
此外，通过对微生物中个体突变的分析，可以检测到微生物中与疾病相关的突变，并进一步阐明疾病的病理生理机制。
在微生物物种的系统发育和分类研究中，全基因组重测序技术同样具有重要的作用。
利用序列数据进行分析，可以得到微生物物种的系统分类树，研究微生物群落中物种的构成和演化关系。
此外，在微生物种群的遗传多样性研究中，全基因组重测序技术几乎已经成为了标准的研究工具，对于不同微生物物种之间的遗传多样性进行深入的比较和分析。
3. 全基因组重测序技术的优缺点全基因组重测序技术的优点在于快速、准确、灵敏和可重复性高，可以为我们提供比较全面的微生物物种信息。
此外，全基因组重测序技术对于检测微生物中新的基因和功能也有很大的帮助，有助于进一步挖掘微生物生物学的潜力。
然而，全基因组重测序技术也存在一些局限性。
其中最明显的问题是重测序过程中的DNA损失和断裂，这可能导致测序结果的不准确性。
此外，全基因组重测序技术对于不同物种之间的比较和分析存在一定的局限性，需要结合其他分析方法来解决。
Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
Ion torrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案微生物全基因组重测序文库构建实验方案一、重测序原理全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线培养至对数期的单一菌落↓基因组DNA提取细菌DNA↓超声波打断 DNA片段化↓文库构建↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序↓生物信息学分析DNA片段化↓末端修复↓纯化接头连接、缺口修复↓纯化文库片段筛选↓文库片段扩增↓纯化 Agilent Test、Qubit定量↓ Ion OneTouch System 重测序三、实验方案 1.细菌总DNA的提取液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA 量。
细菌DNA采用试剂盒提取法。
取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。
提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。
通过测定OD260/280，范围在之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。
片段化采用Covaris System超声波打断仪，将待测DNA打断步骤：1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线，软件界面显示为绿色3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng 或1μg，加入Low TE至总体积为50mL4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”6）打断结束后，将混合液转移至一支新的离心管中3.末端修复及接头连接末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤：1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）用20μL墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中 9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接4.接头连接、缺口修复和纯化片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头接头连接在体系中加入 DNA 25μL 10×Ligase Buffer 10μL Ion P1 Adaptor 2μL Ion Xpress Barcode X+ 2μL dNTP Mix 2μL Nuclease-free water 49μL DNA Ligase 2μL Nick pair polymerase8μL Total 100μL将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增 25℃15min72℃5min 4℃hold 循环×1立即转移至一个新的离心管中纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体 6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中5.文库片段筛选方案1E-Gel Agarose System采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
微生物领域中的基因测序技术使用教程
微生物领域中的基因测序技术使用教程基因测序技术是现代生命科学研究中的重要工具，它可以揭示生物体内基因组的组成和结构，从而更好地理解微生物的功能和遗传特性。
本篇文章将向您介绍微生物领域中常用的基因测序技术及其使用教程。
1. Sanger测序法Sanger测序法是一种经典的基因测序技术，它基于DNA合成中的“链终止法”原理。
首先，将待测的DNA片段在PCR反应中扩增，然后将扩增产物与引物、DNA聚合酶和一种特殊的二进制分子链终止剂（如二进制dTTP）一起放入反应体系。
这样，在DNA复制的过程中，发生终止反应的碱基将会在扩增产物中引入一些短的链终止片段。
通过电泳分离这些链终止片段，并用荧光标记的引物进行测序，就可以获得DNA序列的信息。
2. 双链DNA测序（Shotgun测序）双链DNA测序是一种高通量基因测序技术，该技术广泛应用于微生物全基因组测序。
它通过将基因组DNA随机剪切成小片段，并进行文库构建，然后将文库进行扩增和测序。
随后，利用计算机算法将这些片段拼接起来，从而得到完整的基因组序列。
相较于Sanger测序法，双链DNA测序具有更高的测序效率和通量。
3. 16S rRNA测序16S rRNA测序是一种常用于微生物分类和鉴定的技术。
16S rRNA是细菌和古菌中高度保守的基因，因而每个菌株的16S rRNA序列都具有一定的差异。
通过将微生物样品中的16S rRNA基因进行扩增和测序，可以得到微生物的16S rRNA 序列信息，并通过与数据库中已知的16S rRNA序列比对，进行微生物分类和鉴定。
这种方法可广泛应用于微生物多样性研究、环境样品中微生物群落的研究和微生物致病性的评估等领域。
4. 宏基因组测序宏基因组测序（metagenomics）是一种用于研究复杂微生物群落的技术。
与传统的基因组测序技术不同，宏基因组测序对微生物群落样品中所有的DNA进行高通量测序。
通过使用二代测序技术，可以同时测得微生物群落中所有个体的基因组序列。
微生物基因组测序分析策略
微生物基因组测序分析策略微生物基因组测序分析策略是一种实验室技术，用于确定微生物体内基因组的DNA序列。
这项技术可以通过分析微生物体内的基因组来深入了解微生物的功能、进化和适应能力。
以下是一种常用的微生物基因组测序分析策略。
1.样品准备：首先需要收集微生物样品，包括细菌、真菌、病毒等。
收集的样品可以是从环境中采集的，也可以是从病人体内获取的。
样品的收集需要遵循严格的操作规程，以防止样品受到外源性DNA的污染。
2.提取基因组DNA：从收集的微生物样品中提取基因组DNA。
这可以通过多种方法来实现，如传统的酚-氯仿法或商业化的基因组DNA提取试剂盒。
3.构建文库：提取的基因组DNA需要经过文库构建过程，以便将其转化成可以进行测序的DNA片段。
现代文库构建方法包括PCR扩增、DNA酶切、末端修饰、连接至适配体等步骤。
4. 测序：构建好的文库将进入测序阶段。
现阶段，有多种测序技术可供选择，如Sanger测序、454测序和Illumina测序等。
Illumina测序是最常用的高通量测序技术，其特点是产出高质量的短读长测序结果。
5.数据处理：经过测序仪测序后，将获得大量的测序数据。
这些数据需要进行数据处理以从中提取基因组的信息。
这一步骤包括去除低质量的读段、去除适配体序列、去除重复读段等，以减少数据噪音。
6.基因组组装：通过将测序数据进行比对、拼接和重组，可以得到微生物基因组的完整序列。
基因组组装是一种复杂的过程，需要借助专业软件和算法进行。
7.基因预测：通过使用基因组注释工具和数据库，可以对组装好的基因组序列进行基因预测。
这一步骤可以帮助鉴定微生物的功能基因、代谢途径和生理特征等。
8.数据分析：通过比对、聚类、功能注释和代谢通路分析等方法，对微生物基因组进行进一步的分析。
这些分析可以提供有关微生物的进化关系、代谢网络和抗药性基因等信息。
9.结果解释：最后，将数据分析结果进行解释，并与现有的研究结果进行比较和验证。
微生物重测序
微生物重测序
近年来，微生物重测序（metagenomics）作为一种新兴基因组技术，越来越受到科学界的关注。
它可以通过全基因组测序来研究微生物群落的多样性和进化。
这种技术的应用范围十分广泛，能够有效地解决一些关于微生物的技术问题。
例如，微生物重测序可以用于研究天然水体，如地下河流或湖泊，以及工业废水，例如化工污水处理系统中的水。
微生物重测序技术可以帮助研究者了解微生物群落的结构、组成及其功能。
通过全基因组测序，研究人员可以同时获得微生物样品中的基因信息，而无需先鉴定出这些微生物。
这种技术对研究微生物多样性和进化具有重要意义，因为它可以揭示微生物群落的变化和不同的环境因素如何影响微生物群落的总体结构。
此外，微生物重测序技术还可以应用于研究微生物群落中物种的相互作用。
研究人员可以通过基因表达研究，了解某些物种对其他物种的影响。
此外，由于微生物重测序技术可以同时测序多个物种，因此可以获取多种物种在环境中的表达模式。
另外，微生物重测序可以用于研究不同环境中的微生物群落结构。
例如，研究者可以比较洗衣服前后的衣物微生物群落的变化，以及研究工业废水处理过程中的微生物群落结构变化。
此外，微生物重测序还可以用于发现新型微生物、研究微生物线粒体的进化驱动力以及研究微生物抗性基因的分布情况。
总之，微生物重测序是一个极具潜力的技术，可以帮助研究者研
究微生物群落的多样性和进化，也可以用于研究微生物群落中物种的相互作用，以及不同环境中的微生物群落结构。
它的突出优势就是可以快速、灵活地获取大量的微生物数据，从而为研究微生物多样性和进化提供有力的科学依据。
高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理篇4
高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理篇4到目前位置ThermoLife公司在IonTorrent平台上，推出了两款测序仪，小的叫PGM测序仪（Personal Genome Machine 的意思）。
大的叫Proton测序仪。
IonT orrent平台的主要测序优势，是可以从很少的DNA量来进行测序，一般情况下5～10个ng的DNA就足够进行一次质量良好的测序了。
这个优势，是基于Thermo Life公司推出了一系列基于多重PCR 的建库方案，AmpliSeq是Ion Torrent平台上很好用的一个建库方案。
它的核心就是通过多重PCR方法，一次从样本中把要测的多个DNA 片段给扩增出来。
然后转化成文库，进行测序。
Thermo Life公司基于其多年做PCR的经验，推出了这个AmpliSeq平台，在AmpliSeq平台上一方面推出了许多成熟的测序Panel，另外客户可在AmpliSeq平台上自行定制适合自己的AmpliSeq Panel。
所谓Panel，就是一系列针对客户感兴趣的基因片段，所做的扩增引物或者杂交探针组合。
Ion Torrent测序平台一直有一个Homopolymer问题，所谓Homopolymer问题，就是测序仪在测到一连串相同的碱基的时候就读不准到底有几个碱基。
ThermoLife公司最近推出了Hi-Q酶，这个酶的特点就是聚合反应非常快。
也就是它所产生的PH值变化的峰，更高、更尖，更利于判读，这在相当大的程度上提高了Ion T orrent测序仪读Homopolymer 区域时的准确性。
油包水PCR反应是一个对操作很敏感的实验步骤，为了提高实验结果的一致性，也为了减少人工消耗，ThermoLife公司还在Ion Torrent平台上推出了半自动的油包水PCR反应仪“One T ouch”和全自动的油包水PCR反应仪“Ion Chef”。
Ion T orrent平台的测序仪，还有一个优点，就是它的测序速度比较快。
高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理篇2
高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理篇2在做好文库之后，接着就要做第二步，就是把文库种到测序珠子上去，并且进行扩增。
文库通过油包水PCR，变成可上机的珠子的过程；Ion Torrent把文库种到测序珠子上去的方法，是做油包水PCR。
也叫emulsion PCR（乳浊液PCR）。
油包水PCR包括两个相：油相和水相。
其中水相是核心，油相起到分隔作用。
水相中包括了：文库、引物、酶、MasterMix、测序珠子这5种PCR反应的主要成分。
其中这个测序珠子，是接下来测序的核心载体。
这个测序珠子是非常小的，PGM测序仪上用的珠子，它的直径大概平均是2.4微米。
Proton P1测序芯片上用的珠子，它的直径，大约只有一个微米。
这些珠子的表面，共价连接了许多的PCR引物，这个引物的序列正好是和前面文库的P1接头是互补的。
每一个油包水PCR都会包含许许多多个这样的，小的测序微珠。
水相中的另外一个成分是那个游离的PCR引物，这个游离的PCR 引物，它的5’端标记了生物素。
这个标记的生物素的作用，我们后面还要提到，这个引物的序列是和前面的A接头或者X接头相一致。
准备水相，就是把文库、引物、酶、MasterMix、测序珠子现在水相中混合好，混合好之后加入油，把油和水进行混合，形成乳浊液。
在这个乳浊液当中，大部分是油。
油把水相分隔成一个一个的小水滴，每个小水滴当中都可能含有0个到若干个文库分子。
还会包含9个到若干个的小的测序微珠。
与此同时，引物、酶和dNTP是过量的，所以几乎每个小水滴当中都会有足量的引物、酶和dNTP，在整个油包水PCR反应当中，文库分子和测序微珠是限量因素。
接着，把混合好的乳浊液进行PCR反应，PCR反应的结果是一个小水滴中，如果它同时有文库分子和测序微珠，那么它就会发生PCR 反应，如果缺少文库分子或者测序微珠，就不会发生PCR反应。
PCR反应之后，珠子的表面就会长出同一个液滴当中，所含的DNA（文库）分子的扩增拷贝来。
基因组重测序流程
基因组重测序流程基因组重测序是一种现代生物技术，它可以帮助人们深入了解生命的奥秘。
本文将以人类视角，生动地叙述基因组重测序的流程。
第一步，样本采集。
基因组重测序需要获取待测序的生物样本，可以是人体组织、细胞或其他生物体的DNA。
科学家们小心翼翼地收集这些样本，以保证其完整性和纯度。
第二步，DNA提取。
为了进行基因组重测序，我们需要从样本中提取出DNA。
这一步骤非常关键，要确保DNA的完整性和纯净度。
科学家们采用各种方法对样本进行处理，分离出DNA，并将其保存在试管中。
第三步，文库构建。
文库是指将DNA样本转化为能够进行测序的文库，其中包含了DNA片段的信息。
科学家们将DNA进行剪切，然后连接到适当的载体上，形成文库。
这一步骤需要精确操作，以确保文库的质量和完整性。
第四步，测序。
测序是基因组重测序的核心环节。
科学家们利用高通量测序技术，对文库中的DNA进行测序。
通过测序仪器，我们可以得到大量的DNA序列数据。
第五步，数据分析。
测序完成后，我们需要对得到的DNA序列数据进行分析。
科学家们利用计算机软件，对这些数据进行处理和解读。
他们会比对已知的基因组数据库，将测序数据与已有的基因序列进行比对，以获得更多的信息。
第六步，结果解读。
在数据分析的基础上，科学家们对测序结果进行解读。
他们会分析哪些基因存在变异、突变或重排等情况。
这些结果能够帮助我们了解基因与疾病之间的关联，为疾病的预防和治疗提供重要的依据。
基因组重测序是一项复杂而精密的技术，它为我们提供了深入研究基因组的机会。
通过这个过程，我们能够了解基因的结构和功能，揭示疾病的发生机制，为个性化医疗和疾病预防提供有力支持。
科学家们在这个领域不断探索，希望能够更好地利用基因组重测序技术，造福人类健康。
微生物重测序
微生物重测序
微生物重测序是一种技术，用于确定微生物群落的遗传多样性。
它通过对多个微生物样品中的DNA片段进行组装，以及比对其序列来识别出微生物类群的方法。
它不仅可以识别出微生物群落中的物种，还可以检测出微生物群落中的遗传变化。
微生物重测序技术是一种新兴的研究手段，能够快速、高效地揭示微生物群落的遗传多样性。
它可以用来识别和分类各类微生物，并追踪变化，从而为生物多样性的保护和管理提供科学基础。
微生物重测序技术的原理是，将微生物样品中的DNA 提取出来，然后将提取的DNA片段组装成完整的DNA序列，并将其与已知的微生物基因组序列进行比对，从而分析出样品中的微生物类群。
一般情况下，使用16S rRNA作为DNA序列比对的参考序列，因为16S rRNA在不同物种之间变异较小，可以用于识别和分类各类微生物。
微生物重测序技术非常方便，可以大大缩短分析时间，并且可以检测出微生物群落中的遗传变化。
通过对不同样品中的微生物多样性进行比较，可以获得关于微生物群落的更多信息。
例如，可以判断微生物群落的变化是否
出现于一个环境因子的影响，或者是否出现于病原体的活动。
此外，微生物重测序还可以为发现新物种提供帮助。
比如，通过对细菌样品中的DNA序列进行比对，可以发现一些与已知物种的DNA序列相似但不完全相同的新物种。
因此，微生物重测序是一种非常有用的技术，可以用来快速、高效地检测微生物群落中的遗传变化，以及发现新物种。
它不仅可以为生物多样性的保护和管理提供科学基础，也可以为生物多样性的发现和研究提供帮助。
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3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清
4）重复第三步
5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体
5.片段纯化
方案2
采用琼脂糖凝胶电泳，胶回收法
步骤：
制备1%琼脂糖凝胶
1）称取0.7g琼脂粉置于锥形瓶中，加入70mL 1×TAE
2）锥形瓶放置于微波炉中加热至融化，取出，将融化的凝胶转移至凝胶区专用的100mL小烧杯中，向小烧杯中加入35μL 0.5μL/mL的EB（或其他染色物，如goldview，duRed等，使用浓度和用量各不相同）
6.2扩增产物纯化
1）体系中加入195μL Agencourt AMpure XP Reagent
2）上下震荡5次，瞬时离心后室温放置5min
3）将离心管放置于DynaMag-2磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上
4）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清
采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
主要步骤：
1.上胶将E-Gel系统包含的2%Agarose凝胶安装到基座上
2.点样胶孔内加入250n开始电泳
4.片段回收根据Ladder选择需要回收的片段切胶回收
3）室温放置20min
3.2片段纯化
片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行
步骤：
1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上
3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE至总体积为50mL
4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子
5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”
5）120V电泳15~20min，蓝色条带到距离另一侧边缘1~2cm时停止电泳
6）将凝胶放置到切胶仪上，在紫外灯下迅速将200bp左右的片段切胶回收
7）使用胶回收试剂盒，按照说明书操作步骤，实现200bp左右大小片段的筛选6.片段扩增
6.1 100ngPCR体系扩增采用Ion Plus Fragment Library Kit
6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min
7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合
8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mAgarose System微生物（细菌）全基因组重测序构建实验方案一、重测序原理
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线
培养至对数期的单一菌落
↓基因组DNA提取
细菌DNA（纯化）
↓超声波打断DNA片段化↓构建↓Ion OneTouch
乳液PCR、ES
3）将染液充分混匀，倒入装有制胶板且插上了梳子的胶槽中，待凝胶冷却后，轻轻拔下梳子，将装有凝胶的制胶板放入到电泳槽中，其中电泳槽内装有1×TAE缓冲液，没过胶约1~2mm
4）加样。向装有20μL的片段化DNA离心管中加入2μL的6×loading buffer，将离心管内的DNA溶液转移到胶孔中，同时在于凝胶间隔的位置点入3~5μL DL 1000 marker
细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。
取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的n Proton
上机测序
↓
生物信息学分析
三、实验方案
1.细菌总DNA的提取
液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。
8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）
9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接
4.接头连接、缺口修复和纯化
片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头
4.1接头连接
在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）
DNA 25μL
10）将转移的离心管放置到磁力架上至少1min，将上清液小心转移到一支新的1.5mL离心管中
7.Agilent Test & Qubit Qualify
片段大小在200bp左右，片段浓度不低于1μL/mL
8.Ion OneTouch
在Ion OneTouch仪上使用Ion OneTouc及芯片上样等操作，完成测序芯片的准备。
5）重复第四步
6）瞬时离心后，放置于磁力架上，用20μL墙头小心吸去多余的液体
7）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min
8）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合
9）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）
9.上机测序
使用Ion PGM进行测序。
10×Ligase Buffer 10μL
Ion P1 Adaptor2μL
Ion Xpress Barcode X+2μL
dNTP Mix 2μL
Nuclease-free water49μL
DNA Ligase 2μL
Nick pair polymerase 8μL
Total 100μL
将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增
6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中
3.末端修复及接头连接
3.1末端修复
使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s
步骤：
1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL
2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL
2.DNA片段化
采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断
步骤：
1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg
2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色
25℃15min
72℃5min
4℃hold
循环×1
立即转移至一个新的1.5mL离心管中
4.2纯化
片段纯化使用A140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清
4）重复第三步
5）用20μL墙头小心吸去多余的液体
6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min
7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合
体系包括：
Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100μL
Library AmplificatioL
放入PCR仪中，按以下循环进行：
95℃5min
95℃15s
58℃15s 8个循环
70℃1min
4℃hold