picbio三代测序原理
一代,二代,三代测序原理
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
二代测序
二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，高通量测序技术， 是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。刚面世时主要包括Roche公司的454技 术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测 序的通量，大大降低了测序成本和周期。
➢ 二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。
二代测序
二代测序
测序流动槽(flowcell)： 每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与两 端的接头互补。DNA聚合酶
P5 P7
桥式PCR合成另一条链
NaOH解开双链
NaOH解开双链 后模板链被洗掉
二代测序
流动槽加入引物 Rd1 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第一条链测序
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
揭晓你所不了解的第三代测序技术
揭晓你所不了解的第三代测序技术什么是第三代测序技术？百众源生物微信第三代测序技术是指单分子测序技术。
DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。
如果你还记得，我们之前说过二代测序之所以要进行PCR扩增是为了放大信号，而在第三代测序里，在没有进行PCR扩增的情况下，是怎样做到对碱基信号的识别的呢？本文为你揭晓。
1.第三代测序技术原理第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国Helicos Biosciences的SMS技术和美国太平洋生物（Pacific Biosciences）的SMRT（single molecule real-time,SMRT）技术。
HelicosBiosciences公司虽然第一个成功的开发了单分子测序技术，但未能解决读长的问题，最后公司运营失败，被迫在2012年关闭。
所以，目前所剩的第三代测序技术只有Pacific Bioscience公司推出的单分子实时DNA测序仪。
其实纳米孔测序（nanopore sequencing）在国外也被称为第三代测序技术，但是国内大家喜欢把它列为第四代测序技术。
Pacbio的测序原理是：DNA聚合酶Phi29和模板结合，4色荧光标记4种带荧光集团的碱基（即是fluoro-dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
当加入的碱基与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
同时这DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。
第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。
新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。
三代测序原理
三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。
与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。
第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。
这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。
在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。
然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。
接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。
这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。
在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。
这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。
通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。
总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。
这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。
二代和三代测序原理及技术详解
二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。
二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。
本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。
二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。
首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。
然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。
最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。
Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。
其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。
在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。
Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。
Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。
其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。
Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。
与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。
PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。
PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。
一代-二代-三代测序原理
• 化学试剂三羧基乙基膦（TCEP）淬灭荧光信号；有时荧光基团切割不完全给簇形成荧光背景，导致测序够长。 • 叠氮保护基团遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)会发生断裂，并在原来的位置形成羟基，供下一个碱基合上。
一代测序
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
三代测序
SMRT 测序优势
优势4 ：实时检测碱基修饰信息
三代测序
三代测序
三代测序
SMRT 测序建库
三代测序
Thank you for time
流动槽加入引物 Rd2 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第二条链测序。
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长针对PacBio单分⼦测序——第三代测序技术的测序原理和读长DNA基因测序技术从上世纪70年代起，历经三代技术后，⽬前已发展成为⼀项相对成熟的⽣物产业。
测序技术的应⽤也扩展到了⽣物、医学、制药、健康、农林、园艺、花卉、环保、法医等许多领域，并成为⼀项与我们⾐⾷住⾏密切相关的⾼技术产业。
据最新统计，2012年全球基因测序市场的产值已超过百亿，按最近⼏年增长速度，预计2017年市场产值将加倍。
因此可以说，基因测序在我国⽣物科技领域具有⾮常重要的战略意义。
“第三代测序技术”的研发已有近⼗年时间，商业化的第三代测序仪上市也有三年,⽬前，国内对Pacbio单分⼦测序研究也有了最新进展：⼀，中科院药植所采⽤PacBio单分⼦测序揭⽰丹参叶绿体DNA修饰之间复杂的相互作⽤：编码及⾮编码RNA的表达2014年6⽉10⽇，中科院药⽤植物研究所（IMPLAD）刘昶团队在《PLOS ONE》杂志上发表了利⽤PacBio测序技术揭⽰丹参（Salvia miltiorrhiza）叶绿体DNA修饰之间复杂相互作⽤的相关⽂章，该⽂章报道了丹参叶绿体中编码及⾮编码RNA的表达情况。
这也是国内PacBio第三代测序⽤户在国际性杂志发表的第⼀篇⽂章。
丹参是最⼴泛使⽤的药⽤植物之⼀。
作为基于叶绿体基因⼯程⼿段开发使丹参活性成分过表达⽅法的第⼀步，该研究团队从基因组，转录组，和碱基修饰三⽅⾯对丹参叶绿体进⾏了分析。
先从新鲜叶⽚中提取总基因组DNA和RNA，然后进⾏链特异性RNA测序和PacBio 公司的单分⼦实时（Single-Molecule Real-Time, SMRT）测序分析。
实验先是将RNA测序得到的reads mapping到基因组，使该研究⼩组确定了80个蛋⽩质编码基因的相对表达⽔平。
此外，还明确了19个多顺反⼦转录单元和136个假定反义和基因间⾮编码RNA（ncRNA）基因。
第三代测序技术的原理和应用
第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。
第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。
为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。
本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。
第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。
第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。
2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。
这大大提高了测序速度，并降低了成本。
3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。
这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。
第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。
以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。
2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。
3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。
4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。
5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。
第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。
三代测序原理及步骤
三代测序原理及步骤
三代测序是一种新型的高通量测序技术，与传统的二代测序技术相比，具有更快的速度、更高的分辨率和更低的成本。
三代测序的原理主要分为三个步骤：预处理、测序和数据分析。
1. 预处理：样本DNA需要进行预处理，包括DNA提取、文
库构建和引物连接等。
其中文库构建过程中，DNA分子被打
断成较小的片段，并与适当的引物序列连接。
这个过程是为了克服DNA分子长度和连续读取长读长的难题。
2. 测序：三代测序主要依赖于单分子测序技术。
这种技术可以直接读取单个DNA分子的序列信息，避免了文库扩增和PCR
等步骤对序列的干扰。
常用的三代测序技术包括SMRT （Single Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
其中，SMRT测序技术利用圆盘形态的DNA多聚酶在放射线观测下
合成DNA，观察到DNA的添加情况，从而得到DNA的序列
信息；Nanopore测序技术则利用微小的纳米孔通过测量DNA
分子通过孔的电导变化来分析DNA序列。
3. 数据分析：三代测序产生的数据量大、复杂，需要进行数据预处理、序列比对、变异检测、基因组组装等一系列的数据分析步骤。
这些步骤主要包括数据清洗、基因组或转录组的组装、SNP分析、结构变异分析等。
总体来说，三代测序的步骤包括预处理、测序和数据分析。
通
过这些步骤，可以高效地获得高质量的基因组或转录组序列，并进一步分析相关的生物学功能和基因表达调控等信息。
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理The manuscript can be freely edited and modified三代测序之P a c B i o S M R T技术全解析2017-05-1111:29来源:气温回升;天气渐暖;花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里;我们准备聊点新话题..今天小编要来和你分享：PacBioSMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展;PacificBiosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台;让三代测序正式走入我们的视线..与前两代相比;第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBioSMRT测序平台..PacBioSMRT测序原理PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统SingleMoleculeRealTime;SMRT应用了边合成边测序的原理;并以SMRT芯片为测序载体..基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列;锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射;发出荧光;检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配;在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短;区分匹配碱基与游离碱基;获得DNA序列酶反应过程中;一方面使链延伸;另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行;测序同时持续进行PacBioSMRT测序原理PacBioSMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔zero-modewaveguides;ZMWs和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上Phospholinkednucleotides..SMRTCell含有纳米级的零模波导孔;每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序;并实时检测插入碱基的荧光信号..ZMW是一个直径只有10~50nm的孔;当激光打在ZMW底部时;只能照亮很小的区域;DNA聚合酶就被固定在这个区域..只有在这个区域内;碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到;大幅地降低了背景荧光干扰.. SMRTCell和ZMWs将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上;当核苷酸掺入到新生的链中;标记基团就会自动脱落;减少了DNA合成的空间位阻;维持DNA链连续合成;延长了测序读长..SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性;是最接近天然状态的聚合酶反应体系..荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸PacBioSMRT测序送样要求PacBioSMRT测序建库流程DNA打断之后;经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定;即可出库准备上机测序;建库过程无PCR反应..PacBioSMRT建库流程PacBioSMRT技术特点PacBioSMRT技术有两种测序平台;RSⅡ和Sequel;应该如何选择小编已将二者的对比表准备好啦~表3RSⅡ和Sequel测序平台比较Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势;Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短..1.第三代基因测序技术又被为"SingleMoleculeRealTimeSMRT DNASequencing"单分子实时DNA测序技术;该方法基于纳米孔的单分子读取技术;不需要扩增即可快速读取序列..目前;PacificBiosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacB ioRS平台;使得第三代测序正式走入人们的视角..PacBioRSII是PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统SingleMolecu leRealTime;SMRT;其专利的SMRTCell含有15;000个纳米级的零模波导孔zero-mod ewaveguides;ZMWs;每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序;并实时检测插入碱基的荧光信号..2.2技术特点ü 利用测序过程聚合酶反应的动力学变化;首次实现对碱基修饰进行直接测序..ü 超长的读长：平均测序读长能达到7;000-8;000bp;最长读长能达到3;0000bp；ü 准确率高：对基因组组装和基因组变异检测;可以最多达到99.999%的准确率；ü 敏感性强：可以检测频率在0.1%的minorvariants；ü 无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增;避免了覆盖度不均一和PCRartif acts；ü 最小的GC偏好性GCbias：在极端高GC和极端低GC区域;可以轻松测定;从而保证序列的均匀覆盖度..3.3数据产出试剂盒平均读长数据量/SMRTCellP4-C2Chemistry 5.5-6Kb ~200MbP5-C3Chemistry 8-10Kb ~250Mb4.4应用领域1全基因组denovo测序与二代测序最高不超过1kb的读长相比;PacBioRSII的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题..同时;与二代测序的模板样品需要扩增相比;PacBioRSII无需扩增可直接对单个分子进行测序;有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性;PacBioRSII可轻松跨越GC含量异常过高或过低及高度序列重复的区域;实现序列覆盖的完整性和均一性..2基因组草图的优化或基因组完成图绘制对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升..针对前期已经开展全基因组测序;获得基因组草图的动植物、微生物等;可以结合PacBioRSII平台长读长reads进行补充;从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度..另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息structural -variationevents、串联重复序列信息tandemduplication、易位信息Inversion 等..尤其在微生物基因组完成图的绘制中;可在一天之内、成本低于$1;000即可将基因组完善获得0gapcontig..3全长转录本测序PacBioRSII的长读长可实现全长转录本测序;并使基因可变剪接形式的识别成为可能;因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究..同时;长读长不再需要对RN A-Seq的reads进行组装;因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释;用以改进参考基因组中的基因注释信息..4宏基因组测序长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定;能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列..516SrDNA全长测序PacBioRSII的平均读长为8-10Kb;而16SrDNA长度大约为1540bp;因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列..6细胞器基因组测序叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构;Pac BioRSII的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等;基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs及indel信息..7全基因组重测序&稀有变异鉴定PacBioRSII长读长测序reads无GC偏号;能够全面获得基因组的遗传变异;包括SN Ps的鉴定到CNV、SV结构变异等;可运用至人类癌症基因组重测序等..PacBioRSII 平台测序周期在10hours小时即可完成测序;可应用至需要快速反馈的临床检测中;如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等;取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可..8表观遗传学PacBioRSII利用测序过程聚合酶反应的动力学变化;首次实现对碱基修饰进行直接测序..当碱基有额外修饰时;DNA聚合酶的合成速度会减慢;对应的信号会被检测出来..每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBioRSII产生微小差异;最终反映到荧光脉冲信号的间隔上..除了甲基化修饰;还可以检测5-hC、5-hmU、5-h U、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰;甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰..PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息;只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息..5.5。
三代基因组测序技术原理简介
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
图2：Sanger法测序原理第二代测序技术总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
第三代基因测序原理及应用
发展前景展望
提高准确性
随着技术的不断发展和优化，未来第三代测序技术的准确性将得到 进一步提高，有望接近甚至超过传统测序技术。
降低成本
随着技术的普及和规模化应用，第三代测序技术的成本有望进一步 降低，使得更多人能够享受到高精度基因组测序服务。
拓展应用领域
随着第三代测序技术的不断发展和完善，其应用领域也将不断拓展 ，包括复杂疾病研究、精准医疗、生物多样性保护等。
缺点
测序准确度相对较低，且对DNA样 品的质量要求较高。
链接测序技术
原理
通过连接反应将DNA片段连接成 更长的序列，然后对连接产物进 行测序。连接反应具有高度的特 异性，可以准确识别碱基序列。
优点
测序准确度高、读长较长、适用 于复杂样本的测序。
缺点
测序速度相对较慢，且连接反应 可能受到多种因素的影响，如温 度、pH值等。
挑战与问题
高错误率
第三代测序技术的错误率相 对较高，尤其是在连续测序 过程中，错误率可能会逐渐 累积，影响测序结果的准确
性。
数据处理难度
由于第三代测序技术产生的 数据量巨大，对数据处理和 分析的要求也相应提高，需 要更强大的计算能力和更高
效的算法支持。
成本问题
目前第三代测序技术的成本 仍然较高，限制了其在大规 模基因组测序等领域的应用 。
多维度数据挖掘
利用多组学数据，挖掘基因、环境、生活方式等多因素对人体健康和疾病的影响，为个性化医疗和精准预防提供 科学依据。
智能化和自动化发展方向
自动化样本处理
通和准确性。
智能数据分析
利用人工智能和机器学习技术，对测序数据进行自动分析和 解读，提取有价值的信息和模式，为科研和临床应用提供智 能决策支持。
三代基因组测序技术简介及其原理整理
三代基因组测序技术简介及其原理整理第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。
1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
Sanger法原理：1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。
在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。
2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。
化学裂解法原理：与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。
在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。
反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。
接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
第三代测序技术原理及应用
Pacific Bioscience SMRT 技术
• 优势：长读长，耗时短。可以进行DNA甲基化，高GC含量区域、 RNA等测序。
• 缺陷：会出现插入和缺失错误。 缺失错误源于有时候碱基掺入速度过快， 超过了相机的拍摄帧数; 插
入错误源于有时候酶随机的选择一些碱基，但并未真的将这些碱基掺入 合成链中。但这些错误是随机的，并不会随着读长的增加而提高， 随着 测序覆盖深度的增加会逐渐被消除。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
Pacific Bioscience SMRT 技术
第一代、二代、三代测序仪比较
Rhoads A, Au KF. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2015;13(5):278-289. doi:10.1016/j.gpb.2015.08.002.
• 缺点：测序的平均读长相对较短， 只有 35 bp， 准确率较低， 约为 ≤97% 。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
α-溶血素纳米孔 外：核酸外切酶 内：环糊精传感器
核酸外切酶 消化单链DNA
单碱基与环糊 精作用影响电 流
依据电信号大小和 停留时间识别碱基
测序准确度较高，测序碱基错误率 为1%
第三代测序技术原理
第三代测序技术原理
第三代测序技术是指最新一代的高通量测序技术，它与第一代和第二代测序技
术相比，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的准确性。
第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔测序等多种技术。
本文将重点介绍第三代测序技术的原理及其应用。
首先，单分子测序是第三代测序技术的核心原理之一。
它通过直接测序单个DNA分子，避免了PCR扩增和文库构建等步骤，大大简化了测序流程。
单分子测
序技术主要包括荧光基团标记、逐个核苷酸加入和荧光检测等步骤。
这种原理使得第三代测序技术在测序速度和准确性上有了质的飞跃。
其次，纳米孔测序是第三代测序技术的另一重要原理。
它利用纳米孔将DNA
分子拉伸成单链，然后通过电压驱动DNA分子逐个通过纳米孔，通过测量电流信
号来识别不同的核苷酸。
这种原理使得第三代测序技术可以实现长读长，大大提高了测序的准确性和覆盖度。
最后，合成孔测序是第三代测序技术的又一重要原理。
它利用合成纳米结构来
实现单分子测序，通过控制合成孔的尺寸和形状，可以实现对不同长度的DNA分
子进行测序。
这种原理使得第三代测序技术可以实现更高的测序速度和更低的成本，为基因组学研究提供了强大的工具。
总的来说，第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔
测序等多种技术，它们共同推动了测序技术的发展，为基因组学研究提供了强大的工具。
随着第三代测序技术的不断进步，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
第三代测序技术原理及应用
SMRT cell
Sequel (2015年)
1,000,000 ZMWs /SMRT cell SMRT cell 的通量提高 7 倍 1/3体积
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
第三代测序技术的基本原理及应用
baby诺安
目录
1. 简介 2. 基本原理 3. 应用
简介
第三代测序技术是指单分子测序技术。不同于二代测序依赖片段化 DNA的克隆性扩增，三代测序技术不需要经过PCR扩增，直接对模板中 的每条DNA分子单独测序，避免了潜在的PCR扩增错误和偏好性。同时 超长读长使得一条read可以横跨基因组上的复杂区段或者重复序列，为 基因组组装及准确挖掘与疾病、进化相关的重复原件、拷贝数变异、结 构性变异提供了技术支持。
成像定位 模板位置
洗涤
合成 检测
全内反射显微镜(TIRM)单色成像
Helico BioScience SMS技术
• 测序仪：HeliScope（2008年上市，$1,350,000）
• 优势：样本通量非常高，2 个流动槽可同时运行，每个流动槽有 25 个独立通道，每个通道又可以运行最多 96 个标记分子条形码的样本， 这样每次运行的样本数可高达 4 800 个。把 DNA 聚合酶用逆转录酶 代替还可以进行 RNA 直接测序。
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
质谱测序及第三代测序
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子.每种断裂类型分别生成互补的两种离子,如a-x,b-y,c-z。最常见的是a型离子、b型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
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三代测序之PacBio SMRT技术全解析
2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术
气温回升，天气渐暖，
花儿开了一簇又一簇~
在这美好的季节里，
我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：
PacBio SMRT测序那些事儿~
测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。
PacBio SMRT测序原理
Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：
聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部
4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部
荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光
荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基
统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列
酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落
聚合反应持续进行，测序同时持续进行
PacBio SMRT测序原理
PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，
DNA聚合酶就被固定在这个区域。
只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。
SMRT Cell和ZMWs
将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。
SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。
荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸
PacBio SMRT测序送样要求
PacBio SMRT测序建库流程
DNA打断之后，经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序，建库过程无PCR反应。
PacBio SMRT建库流程
PacBio SMRT技术特点
PacBio SMRT技术有两种测序平台，RSⅡ和Sequel，应该如何选择？小编已将二者的对比表准备好啦~
表3 RSⅡ和Sequel测序平台比较
Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势，Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短。
1.第三代基因测序技术又被为"Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencin
g"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。
目前，Pacific Biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台，使得第三代测序正式走入人们的视角。
PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single M olecule Real Time, SMRT），其专利的SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
2. 2
?技术特点
ü??利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。
ü??超长的读长：平均测序读长能达到7,000-8,000bp，最长读长能达到3,0000bp；
ü??准确率高：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；
ü??敏感性强：可以检测频率在0.1%的minor variants；
ü??无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR art ifacts；
ü??最小的GC偏好性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度。
3. 3
数据产出
试剂盒 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??平均读长 ? ??数据量/SMRT Cell
P4-C2 Chemistry ??5.5-6Kb ? ? ??~200Mb
P5-C3 Chemistry ? ?8-10Kb ? ? ??~250Mb
4. 4
应用领域
（1）全基因组de novo测序
与二代测序最高不超过1kb的读长相比，PacBio RS II的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。
同时，与二代测序的模板样品需要扩增相比，PacBio RS II无需扩增可直接对单个分子进行测序，有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性，PacBi o RS II可轻松跨越GC含量异常（过高或过低）及高度序列重复的区域，实现序列覆盖的完整性和均一性。
（2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。
针对前期已经开展全基因组测序，获得基因组草图的动植物、微生物等，可以
结合PacBio RS II平台长读长reads进行补充，从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。
另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息（stru ctural-variation events）、串联重复序列信息（tandem duplication）、易位信息（Inversion）等。
尤其在微生物基因组完成图的绘制中，可在一天之内、成本低于$1,000即可将基因组完善获得0 gap contig。
（3）全长转录本测序
PacBio RS II的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。
同时，长读长不再需要对RNA-Seq的reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。
（4）宏基因组测序
长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定，能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列。
（5）16S rDNA全长测序
PacBio RS II的平均读长为8-10Kb，而16S rDNA长度大约为1540bp，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。
（6）细胞器基因组测序
叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构，Pa cBio RS II的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等，基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs及indel信息。
（7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
PacBio RS II长读长测序reads无GC偏号，能够全面获得基因组的遗传变异，包括SNPs的鉴定到CNV、SV结构变异等，可运用至人类癌症基因组重测序等。
PacBi o RS II平台测序周期在10 hours小时即可完成测序，可应用至需要快速反馈的临床检测中，如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等，取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可。
（8）表观遗传学
PacBio RS II利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。
当碱基有额外修饰时，DNA聚合酶的合成速度会减慢，对应的信号会被检测出来。
每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBio RS II产生微小差异，最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。
除了甲基化修饰，还可以检测5-hC、5-hm U、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰，甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰。
PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息，只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息。
5. 5
6.。