急性经口毒性实验

实验二 急性经口毒性实验

一、实验目的：

（一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。

（二）通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。

二、测定方法：

本实验以灌胃方式测定敌敌畏DDV 的半数致死量（经口LD50=50～92mg/kg ）。

（一）实验仪器、动物及分组：

1. 健康成年小鼠(18g ～25g)，雌雄各半。动物秤、灌胃针、烧杯、编号笔、解剖剪、小磁盘、鼠笼。

2. 实验前动物要在实验环境中适应3～5 d 时间，以了解其正常活动情况和健康状 况，并淘汰不健康或体重不符合要求的动物 。

3. 本次实验取体重18-25 g 的小鼠，实验时，将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将实验动物分成6组，每组24只，雌雄各半。

（二）剂量选择：

1. 首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的化学物的LD50，以此值作为受试化学物的预期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2 个剂量组，进行预实验。

2. 各剂量组的间距可根据LD50 计算方法要求按等比级数或等差级数安排。

3. 本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为125 mg/kg ，其次剂量组为125 mg/kg *0.8=100 mg/kg ，依次类推为80 、64 和51.2 mg/kg 五个剂量组。

（三）受试化学物配制与稀释

1. 溶剂：

水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液。

脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油等配制。

2. 受试物的稀释

等容量稀释法，各个剂量组的动物均给予相同单位体重体积的受试化学物，按照事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。

例如本次实验五个剂量组:

各剂量组动物给予相同单位体重体积受试物均为10ml/kg 。

等容量稀释法

D ：设计的染毒剂量， mg/kg

V ：动物给药量（相同单位体重体积）均为 10ml/kg X ：各组需配制的受试物溶液的浓度（mg/ml ） 如：第一组染毒剂量D=51.2mg/kg ，动物按V= 10ml/kg 体重给药，配制的受试物浓度为X=51.2mg/10ml

依次类推：五个组所需配制的受试物浓度分别为

第一组：51.2mg/10ml

第二组： 64mg/10ml

第三组： 80mg/10ml

第四组： 100mg/10ml

第五组： 125mg/10ml

另设一个阴性对照组

各剂量组小鼠灌胃容量计算:

V

D X

小鼠灌胃容量V ml=体重（g ）×10ml/1000g

各剂量组小鼠染毒剂量:

小鼠染毒剂量= V ml ×各组的受试物浓度（mg/10ml)

（四）灌胃方法：

小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持连着灌胃导针的注射器，将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即深人至胃部，一般进针深度小鼠2.5～4cm ，随后将受试物溶液注入。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。小鼠一次灌胃体积为10-20ml/kg

（五）中毒体征和死亡情况观察

染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。 高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。

根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。

观察的项目包括：

（1）中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝；

（2）植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；

（3）呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、血性分泌物、呼吸深缓、呼吸过速、仰头呼

吸；

（4）泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；

（5）皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；

（6）眼：眼球突出、结膜充血、角膜浑浊、血性分泌物；

（7）消化系统：腹泻、厌食。

三、LD50 计算：

可采用多种方法测定LD50，有机率单位法、霍恩氏法、寇氏法等，机率单位法能计算出任何反应率水平的剂量，且实验2-5组均可。

机率单位法遵守的要求：

1. 剂量按等比级数排列，相邻两剂量组间的比值常用1：0.8

2. 各实验组动物数相等

☐ 机率单位法计算LD50公式（用五个剂量组时）

☐ X3 ----为第三个组的剂量对数(X3=log 80， 80mg/kg)

☐ i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数(i=log(125/100))

☐ y-----为死亡率相应的机率单位（查附表） ☐ y —

---为五个剂量组的死亡率相应的机率单位的均数。

☐ 1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。

☐ 5.0----为死亡率是50%时所相当的反应率的机率单位

])

y -(y )y -2(y )0.5(10[log 324151

50X y i LD ++-=-

LD 50的95%可信限=log-1(X + 1.96 S X )

四、结果评价：

根据实验动物中毒体征、死亡时间、根据得出的LD50及受试物的种类，按相应的国家标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准（课本 215页--农药的急性毒性分级）对受试物进行毒性定级，判断受试物的毒性大小。

五、注意事项：

1.灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管

2.正确捉拿动物，防止被咬伤且避免动物损伤

3.灌入量计算和操作要准确，否则影响结果

4.

防止操作者中毒。 32415)]y -(y )y -[2(y )0.5(10X y i X ++-=∑

+++=W i 22415222415)]y -(y )y -2(y [)y -0.5(50)]y -(y )y -[2(y 10Sx