基因工程概论

–重组质粒和接合质粒必须有相容性。
1.3 其他的转化方法 PEG介导的细菌原生质体转化
– 高渗溶液中细菌培养至对数生长期 – 溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。 – 加入DNA样品和聚乙二醇等渗液 – 离心除去聚乙二醇，固体培养。
适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。 表5-1 大肠杆菌5种常用转化方法的比较 2 重组子的鉴定 利用插入失活选择pBR322重组 载体：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和头146个aa的编码序列 宿主：缺失了lacZ’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列 α-互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。 转染：是将纯化的噬菌体DNA通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。 体外装配in vitro packaging ：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子 。 体外装配
转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？ 害虫对植株总的危害 虫道的长度 对照虫道长度40.7cm, 转基因植株虫道只有6.3cm。 2.2 基因消减 反义技术的原理 延长货架期的工程番茄
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FLAV SAVR 2.2.1 反义技术的原理 反义技术（antisense） 将克隆的基因反向插入表达载体中，转录成mRNA后，与正义的mRNA是反向互补的。这种 反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。 基因克隆 1980s中期，ICI种子公司生物技术部与Nottinghan大学合作，从多聚半乳糖醛酸酶基因 的5’端克隆了一个730bp的限制性片段，包含一半的编码序列. 表达载体构建（反义） pBIN19质粒，CaMV启动子 遗传转化 重组pBIN19分子转化根癌农杆菌，用来侵染番茄茎段，kan筛选转化子。 转基因植物的分子鉴定： Southern杂交检测反义基因 Northern杂交检测反义基因的转录 单链探针 反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响 正义mRNA表达量 转基因植物的田间鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。 表型鉴定 转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但存放时间明显延长。 反义RNA不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓 成熟过程。 表14－2 反义RNA技术的应用 思考题 植物基因改良的策略？ 反义RNA技术的基本原理？ 转基因植物的鉴定方法？ 植物基因工程的基本步骤 第二代抗虫玉米是如何培育的？ 3 植物基因工程的应用、进展 植物基因工程的应用 GMO的产业化现状
危害也比其它除草剂小，进入土壤后能被微生物迅速降解。
3.3 改良植物品种 强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因 将来自矮牵牛花的EPSPS cDNA转入植物中，转基因酶活比非转基因植物提高了20倍，使 得转基因植物较好地耐受glyphosate的存在。但转基因植物生长缓慢。 3.3 改良植物品种 克隆表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因
连接产物 重组分子 未连接的载体分子 未连接的DNA片段 载体的自连 含有错误插入片段的重组DNA分子 1 转化—细菌吸收DNA的方式 自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。 细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收DNA的能力，经过这样处理的细菌称为感受 态。 1.1 大肠杆菌感受态的制备 感受态细胞(Competent 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载 体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 1.1 大肠杆菌感受态的制备 在冷的盐溶液中转化效率提高。一般利用50mM的CaCl2，或者氯化铷。
植物淀粉合成的控制： 淀粉由直链淀粉与支链淀粉组成，淀粉的质量与淀粉的组成有关。 淀粉合成酶（GBSS）控制直链淀粉合成 分支酶（BE）控制支链淀粉的合成 3.3 改良植物品种 油科植物中脂肪酸合成的控制 人造黄油的工艺是将植物油催化加氢，使其熔点升高，加工成本很高，并且会导致顺式 双链变成对健康不利的反式双链。 将植物内控制脱饱和反应的硬脂酰－ACP脱饱和酶基因的反义基因导入植物中，即可有效 地提高饱和脂肪酸的含量。 3.3 改良植物品种 植物甜味剂合成的控制 Monellin（莫内林）是一种甜味蛋白，来自一种西非灌木植物。相同分子浓度下，它的 甜度为蔗糖的 10万倍。莫内林是一二聚体。A链45aa，B链50aa。两条链一分开，甜味即 消失。限制了它作为食品添加剂的使用。 3.3 改良植物品种 雄性不育 绒毡层特异表达基因 拟南芥AG 烟草TA29 金鱼草tap2基因 番茄108、92b基因 RNase基因 1 2 3 4 5 6 7 8 3.3 品种改良典型事例 抗除草剂，高不饱和脂肪酸含量的转基因大豆 耐储藏西红柿 转富铁基因的金米水稻 转人的血清蛋白的烟草 转Xa21基因抗白叶枯病的明恢63恢复系的选育 转Xa4, Xa5, Xa13及Xa21的多个抗性基因的累加系的选育 抗虫玉米、棉花 终结者技术 特殊性状的遗传利用限制技术 4 转基因植物的安全性 转基因植物的大面积应用，在解决资源短缺、环境恶化、效益衰退三大难题中显示了越来越 重要作用。 GMO的安全性 普斯陶伊事件 1998 年,英国Rowett 研究所的Pusztai 宣称用转GNA 基因的马铃薯饲喂大鼠, “导致大鼠 体重及器官重量严重减轻,免疫系统被损坏”。制造了著名的“Pusztai 事件”,进而在世界 范围内引发了转基因作物安全性的争论。 斑蝶事件 1999 年5 月20 日Losey 等在《Nature》发表了题为“转基因花粉对大斑蝶幼虫有害”的研 究报告。
– 原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。
42°C热激处理。 1.2 筛选转化细胞 1ng的pUC8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的DNA分子。 1.3 其他的转化方法 电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法） 接合转化 微注射法 λ噬菌体的转染 PEG介导的细菌原生质体转化 1.3 其他的转化方法 电激转化
–cos位点突变的噬菌体的单品系系统 –另一种系统需要两种缺陷品系。一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。
3.1 噬 菌 斑 λ形成的是真正的噬菌斑。 M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。 4 重组噬菌体的鉴定 利用插入失活鉴定 λ噬菌体的cI基因的插入失活 利用Spi表型选择 根据λ基因组的大小筛选 4.1 利用插入失活鉴定 4.2 λ噬菌体的cI基因的插入失活 4.3 利用Spi表型选择 4.4 根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可以进入头部结构。 思考题
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α-互补的原理 转化的方法 感受态 Phage的转化方法 选择重组子的方法 农业，更专业的讲是植物生产，是世界上最早的生物技术，可以追溯到10000年以前。 最初几千年，作物的改良是以零星的方式进行的。 最近几个世纪，品种的改进是通过育种程序进行的。 1 转基因的主要方法 根癌农杆菌法(Xa21) 转基因植物中80%； 遗传稳定性较好。 基因枪法(Bt, Xa21） 约10%， 化频率较高， 遗传稳定性较差， 叶绿体、 粒体DNA遗传转化的首选方法。 转 但 是 线 花粉管通道法(中国抗虫棉) 小于10%，中国80%以上，该方法经济方便。 2 植物性状改良的策略 基因附加（gene addition)：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。 基因消减(gene subtraction)：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。 2.1 抗虫转基因植物的培育 研究目的意义及进展 研究方案 研究结果 昆虫是在农业生产中危害最严重的生物逆境。 传统杀虫剂和理想杀虫剂 选择性 容易降解 保护整个植株 苏云金杆菌的δ-内毒素 苏云金杆菌的δ-内毒素 苏云金杆菌在孢子形成过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很 强，要比有机磷毒性高80000倍。 表14-1 不同δ-内毒素 的杀虫范围 苏云金杆菌的δ-内毒素 1904年作为无公害的杀虫剂使用，易降解。 利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定。 通过基因工程使植物合成毒素。 转基因的鉴定 分子鉴定 PCR鉴定 免疫技术鉴定转基因植株是否合成了δ-内毒素。 转基因植株中产生δ-内毒素250-1750 ng/mg。
品种改良典型事例 3.1 植物基因工程的应用 利用报告基因研究植物基因的表达与调控 利用转座元件、T-DNA插入失活克隆植物基因 利用转基因植物生产重组异源蛋白质 改良植物品种 基因表达与调控的研究 报告基因研究植物基因的表达与调控 植物报告基因 大肠杆菌的β－葡萄糖苷酸酶（GUS） 底物：X-Gluc 昆虫的荧光素酶基因 底物：昆虫荧光素、ATP AMP,CO2,光 T-DNA插入克隆基因 利用转座元件克隆植物基因 实质是创造突变体 作为生物反应器生产外源蛋白质 异源蛋白药物 烟草生产医用血清蛋白； 蚕丝纤维基因转入棉花，生产动物纤维 食用或工业用油 制造肥皂和去垢剂的月桂酸 高分子材料 可降解的聚羟丁酯塑料（PHB）及天然棉花与聚酯的混合纤维等 改良植物品种 延迟果实成熟 抗虫 抗病 耐除草剂 改变花型及花色 抗非生物胁迫 提高品质 雄性不育 3.3 改良植物品种 延迟果实成熟 反义技术控制乙烯的合成与信号传导 半乳糖醛酸酶（PG） 3.3 改良植物品种 强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因 少数除草剂的靶部位被鉴定。5-烯醇式为酸基莽草酸－3－磷酸盐合成酶（EPSPS），是 植物叶绿体中芳香族必需氨基酸合成中的一个酶，除草剂glyphosate（glifoseit）抑制 该酶而杀死植物的。 glyphosate在除草剂中使用最为广泛。因为它很少的剂量就能杀灭广谱杂草，对环境的
Klebsiella pneumoniae中的EPSPS对草甘磷亲和性降低了16倍
鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)分离出了一个EPSPS突变体，转入烟草，表 现出了较好的耐性 Monsanto公司的Kishore在E. coli分离出了一个突变体SM-1， 草甘磷的耐性提高了8000 对 倍。 3.3 改良植物品种 除草剂的降解、解毒基因 溴腈衍生物（Bromoxynil）是一种抑制光合成反应的除草剂，Klebsiella ozaenae有一 基因编码一种腈水解酶，能将Bromoxynil降解为3,5－二溴－4羟－苯甲酸。将该细菌基 因转入烟草中已获成功。 3.3 改良植物品种 改变花型、花色 在黄酮类色素物质的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。 3.3 改良植物品种 改变花型、花色 天然的玫瑰没有蓝色的花冠，因为蔷薇科植物缺少合成蓝色色素的酶系，从矮牵牛花中 克隆了一个控制合成蓝色素的基因（3’,5’-羟氧化酶）。期望培育出蓝色的玫瑰。 3.3 改良植物品种 抗非生物胁迫 抗冻蛋白（antifreeze protein, AFP） 脯氨酸合成酶 甜菜碱合成酶 渗调蛋白（osmotin, OSM） 乙醇脱氢酶 3.3 改良植物品种 改良作物的品质 植物淀粉合成的控制 油科植物中脂肪酸合成的控制 植物种子储存蛋白合成的控制 植物甜味剂合成的控制 3.3 改良植物品种
– 受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细
胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。
– 可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。
1.3 其他的转化方法 接合转化
–是由接合型质粒完成的。 –涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供
体菌。
饲养在撒有Bt 玉米花粉的马利筋叶片上的大斑蝶幼虫取食量减小、生长延缓且死亡率 更高。 Bt 玉米的种植面积增加了40 % ,但与此同时大斑蝶的种群也增加了30 %。