基因工程概论

连接产物●重组分子●未连接的载体分子●未连接的D N A片段●载体的自连●含有错误插入片段的重组D N A分子1转化—细菌吸收D N A的方式自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。

细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。

1.1大肠杆菌感受态的制备●感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

1.1大肠杆菌感受态的制备●在冷的盐溶液中转化效率提高。

一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。

–原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。

●42°C热激处理。

1.2筛选转化细胞1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。

1.3其他的转化方法●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法）●接合转化●微注射法●λ噬菌体的转染●P E G介导的细菌原生质体转化1.3其他的转化方法●电激转化–受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

–可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。

1.3其他的转化方法●接合转化–是由接合型质粒完成的。

–涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。

–重组质粒和接合质粒必须有相容性。

1.3其他的转化方法●P E G介导的细菌原生质体转化–高渗溶液中细菌培养至对数生长期–溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。

–加入D N A样品和聚乙二醇等渗液–离心除去聚乙二醇，固体培养。

●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。

表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较2重组子的鉴定●利用插入失活选择p B R322重组●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

●转染：是将纯化的噬菌体D N A通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。

●体外装配i n v i t r o p a c k a g i n g：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子。

●体外装配–c o s位点突变的噬菌体的单品系系统–另一种系统需要两种缺陷品系。

一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。

3.1噬菌斑●λ形成的是真正的噬菌斑。

●M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。

4重组噬菌体的鉴定●利用插入失活鉴定●λ噬菌体的c I基因的插入失活●利用S p i表型选择●根据λ基因组的大小筛选4.1利用插入失活鉴定4.2λ噬菌体的c I基因的插入失活4.3利用S p i表型选择4.4根据λ基因组的大小筛选λ装配系统，只有37k b-52k b的D N A分子可以进入头部结构。

思考题●α-互补的原理●转化的方法●感受态●P h a g e的转化方法●选择重组子的方法农业，更专业的讲是植物生产，是世界上最早的生物技术，可以追溯到10000年以前。

▪最初几千年，作物的改良是以零星的方式进行的。

▪最近几个世纪，品种的改进是通过育种程序进行的。

1转基因的主要方法根癌农杆菌法(X a21)转基因植物中80%；遗传稳定性较好。

基因枪法(B t,X a21）约10%，转化频率较高，但遗传稳定性较差，是叶绿体、线粒体D N A遗传转化的首选方法。

花粉管通道法(中国抗虫棉)小于10%，中国80%以上，该方法经济方便。

2植物性状改良的策略基因附加（g e n e a d d i t i o n)：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。

基因消减(g e n e s u b t r a c t i o n)：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。

2.1抗虫转基因植物的培育研究目的意义及进展研究方案研究结果昆虫是在农业生产中危害最严重的生物逆境。

传统杀虫剂和理想杀虫剂▪选择性▪容易降解▪保护整个植株苏云金杆菌的δ-内毒素苏云金杆菌的δ-内毒素▪苏云金杆菌在孢子形成过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很强，要比有机磷毒性高80000倍。

表14-1不同δ-内毒素的杀虫范围苏云金杆菌的δ-内毒素1904年作为无公害的杀虫剂使用，易降解。

利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定。

通过基因工程使植物合成毒素。

转基因的鉴定分子鉴定P C R鉴定免疫技术鉴定转基因植株是否合成了δ-内毒素。

▪转基因植株中产生δ-内毒素250-1750n g/m g。

转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？▪害虫对植株总的危害▪虫道的长度对照虫道长度40.7c m,转基因植株虫道只有6.3c m。

2.2基因消减反义技术的原理延长货架期的工程番茄▪F L A V R S A V R T M2.2.1反义技术的原理反义技术（a n t i s e n s e）▪将克隆的基因反向插入表达载体中，转录成m R N A后，与正义的m R N A是反向互补的。

这种反向互补为反义R N A，缩写为a s R N A。

基因克隆▪1980s中期，I C I种子公司生物技术部与N o t t i n g h a n大学合作，从多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端克隆了一个730b p的限制性片段，包含一半的编码序列.表达载体构建（反义）▪p B I N19质粒，C a M V启动子遗传转化▪重组p B I N19分子转化根癌农杆菌，用来侵染番茄茎段，k a n筛选转化子。

转基因植物的分子鉴定：S o u t h e r n杂交检测反义基因N o r t h e r n杂交检测反义基因的转录▪单链探针反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响▪正义m R N A表达量转基因植物的田间鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。

表型鉴定▪转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但存放时间明显延长。

▪反义R N A不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。

表14－2反义R N A技术的应用思考题植物基因改良的策略？反义R N A技术的基本原理？转基因植物的鉴定方法？植物基因工程的基本步骤第二代抗虫玉米是如何培育的？3植物基因工程的应用、进展植物基因工程的应用G M O的产业化现状品种改良典型事例3.1植物基因工程的应用利用报告基因研究植物基因的表达与调控利用转座元件、T-D N A插入失活克隆植物基因利用转基因植物生产重组异源蛋白质改良植物品种基因表达与调控的研究报告基因研究植物基因的表达与调控植物报告基因▪大肠杆菌的β－葡萄糖苷酸酶（G U S）底物：X-G l u c▪昆虫的荧光素酶基因底物：昆虫荧光素、A T P A M P,C O2,光T-D N A插入克隆基因利用转座元件克隆植物基因实质是创造突变体作为生物反应器生产外源蛋白质异源蛋白药物▪烟草生产医用血清蛋白；▪蚕丝纤维基因转入棉花，生产动物纤维食用或工业用油▪制造肥皂和去垢剂的月桂酸高分子材料▪可降解的聚羟丁酯塑料（P H B）及天然棉花与聚酯的混合纤维等改良植物品种延迟果实成熟抗虫抗病耐除草剂改变花型及花色抗非生物胁迫提高品质雄性不育3.3改良植物品种延迟果实成熟▪反义技术控制乙烯的合成与信号传导▪半乳糖醛酸酶（P G）3.3改良植物品种强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因▪少数除草剂的靶部位被鉴定。

5-烯醇式为酸基莽草酸－3－磷酸盐合成酶（E P S P S），是植物叶绿体中芳香族必需氨基酸合成中的一个酶，除草剂g l y p h o s a t e（g l i f o s e i t）抑制该酶而杀死植物的。

▪g l y p h o s a t e在除草剂中使用最为广泛。

因为它很少的剂量就能杀灭广谱杂草，对环境的危害也比其它除草剂小，进入土壤后能被微生物迅速降解。

3.3改良植物品种强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因▪将来自矮牵牛花的E P S P S c D N A转入植物中，转基因酶活比非转基因植物提高了20倍，使得转基因植物较好地耐受g l y p h o s a t e的存在。

但转基因植物生长缓慢。

3.3改良植物品种克隆表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因▪K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e中的E P S P S对草甘磷亲和性降低了16倍▪鼠伤寒沙门氏杆菌(S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m)分离出了一个E P S P S突变体，转入烟草，表现出了较好的耐性▪M o n s a n t o公司的K i s h o r e在E.c o l i分离出了一个突变体S M-1，对草甘磷的耐性提高了8000倍。

3.3改良植物品种除草剂的降解、解毒基因▪溴腈衍生物（B r o m o x y n i l）是一种抑制光合成反应的除草剂，K l e b s i e l l a o z a e n a e有一基因编码一种腈水解酶，能将B r o m o x y n i l降解为3,5－二溴－4羟－苯甲酸。

将该细菌基因转入烟草中已获成功。

3.3改良植物品种改变花型、花色▪在黄酮类色素物质的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（C H S）是一个关键酶。

3.3改良植物品种改变花型、花色▪天然的玫瑰没有蓝色的花冠，因为蔷薇科植物缺少合成蓝色色素的酶系，从矮牵牛花中克隆了一个控制合成蓝色素的基因（3’,5’-羟氧化酶）。

期望培育出蓝色的玫瑰。

3.3改良植物品种抗非生物胁迫▪抗冻蛋白（a n t i f r e e z e p r o t e i n,A F P）▪脯氨酸合成酶▪甜菜碱合成酶▪渗调蛋白（o s m o t i n,O S M）▪乙醇脱氢酶3.3改良植物品种改良作物的品质▪植物淀粉合成的控制▪油科植物中脂肪酸合成的控制▪植物种子储存蛋白合成的控制▪植物甜味剂合成的控制3.3改良植物品种植物淀粉合成的控制：▪淀粉由直链淀粉与支链淀粉组成，淀粉的质量与淀粉的组成有关。

淀粉合成酶（G B S S）控制直链淀粉合成分支酶（B E）控制支链淀粉的合成3.3改良植物品种油科植物中脂肪酸合成的控制▪人造黄油的工艺是将植物油催化加氢，使其熔点升高，加工成本很高，并且会导致顺式双链变成对健康不利的反式双链。

▪将植物内控制脱饱和反应的硬脂酰－A C P脱饱和酶基因的反义基因导入植物中，即可有效地提高饱和脂肪酸的含量。