关于生物化学常用试剂配制

常规试剂配制和测定方法

一、溶液的配制

1. Mandels营养盐溶液（1000 mL）

名称重量（g）

硫酸铵（(NH4)2SO4）14

磷酸二氢钾（KH2PO4）20

尿素（H2NCONH2） 3

硫酸镁（MgSO4·7H2O） 3

氯化钙（CaCl2·2H2O） 4

注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）

名称重量（g）

氯化钴（CoCl2·6H2O）

硫酸锌（ZnSO4·7H2O）

硫酸锰（MnSO4·H2O）

硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）

注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。

3. DNS试剂的配制（1000 mL）

（1）取：3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5 g

氢氧化钠（NaOH ）14.0 g

充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min）

（2）加入：酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0 g

苯酚（在50 ℃水浴中融化）mL

偏重亚硫酸钠（Na2S2O5） 6.0 g

（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。

注意：倒入瓶中时要尽量装满！！

4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）

称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含%（w/v）考马斯亮蓝

G-250，%（w/v）乙醇，%（w/v）磷酸。

5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）

名称分子量Mn 重量(g)

柠檬酸（C6H8O7·H2O）210 210

NaOH 40

准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为）

6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定

（1）标准糖溶液的配制

准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 ℃烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。

取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。

取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。（2）标准方程的测定：

①葡萄糖/木糖标准方程的测定

取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液1 mL，DNS溶液3 mL。100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）②酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）

取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）

③酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）

取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖标准溶液mL，DNS溶液3 mL，100 ℃煮沸5 min，水浴冷却后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，测定CMC酶活力），摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）

7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制

注：Na2HPO4，Mr =；mol/L溶液为28.40 g/L

Na2HPO4·2H2O，Mr =；mol/L溶液为35.61 g/L

C6H8O7·H2O，Mr =；mol/L溶液为21.01 g/L

二、酶活力的测定

1. 滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力

采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,., et al,Pure & .,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1 μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：

取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 × 6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项目1#2#3#4#5#6#7#

稀释酶液（mL）0 酶解葡萄糖

标样

0.05 M柠檬酸缓冲液（mL） 1

将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 ℃下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却后加水至50 mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550 nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。

以、、、酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：

2 mg葡萄糖

滤纸酶活力=

60min×(mg/μmol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）