核酸探针技术

第 !! 卷第 " 期
中学生物学
0,’1!! 2,1" !##"
!##" 年
$%&&’( )*+,,’ -%,’,./
文件编号： 3##4 5 678" （ !##" ） #" 5 ###6 5 #!
核酸探针技术
岳朝宽
摘 要
!"#$%&’()*+,-./0
!"#$%%1
23456789:;<=>?=@ABCDEFGHIJKLMNOPQEFRST UV )’( 78 WV )’( 78 5678 文献标识码
,+-
\XYZ[; 目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地
高辛， 二者都是半抗原。 生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有 独特的亲和力， 两者能形成稳定复合物， 通过连接在 亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质（ 如酶、 荧光素 等） 进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体 进行免疫检测， 运用原理类似于生物素的检测。地高 辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标 记的相当， 而特异性优于生物素标记， 其应用日趋广 泛。
$+-
]^_‘Ma5b678 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的
6
情况下， 由核酸合成仪来完成， 可廉价获得大量的此 类探针， 长度一般长约 !"#$" %&， 甚至可达 ’" %& 。如 果已知核酸序列可根据已知 ()* 或 +)* 序列合成 精确互补的 ()* 探针，单一已知序列寡核苷酸探针 能与它们的目的序列准确配对， 可以准确地设计杂交 条件， 以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近 的非完全配对序列杂交， 对于一些未知序列的目的片 段则无效； 如果不知道核酸序列， 可依据其蛋白质产 物 的 氨 基 酸 顺 序 推 导 出 核 酸 序 列 从 而 合 成 ()* 探 针。 人工合成的寡核苷酸片段作为核酸杂交探针应 用十分广泛， 对于检测靶基因上单个核苷酸的点突变 和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
4!
放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到 B. 级； 缺点是易造成放射性污染， 而且同位素半衰期短、 不稳定、 成本高。 因此， 放射性标记的探针不能实现商 品化。目前， 许多实验室都致力于研究非放射性标记 的探针。
３
核酸探针的种类及制备方法 根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为 ?2>
探针、 人工合成的寡核苷酸探针、 单链 =2> 探针、 双 链 =2> 探针等几类。
$+, &’( 78 它具有单链 =2> 探针 ?2> 探针一般都是单链， 主 的优点， 又具有许多 =2> 单链探针所没有的优点， 要是： ?2> C =2> 杂交体比 =2> C =2> 杂交体有更高 的稳定性，所以在杂交反应中 ?2> 探针比相同活性 的 =2> 探针所产生信号要强。 ?2> C ?2> 杂交体用 胰 ?2> 酶） 切比用 )3 酶切 =2> C ?2> 杂 ?2> 酶 > （ 交体容易控制， 所以用 ?2> 探针进行 ?2> 结构分析 比用 =2> 探针效果好。 ?2> 的探针制备过程是将一段含完整或部分基 因的 =2> 片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切
核苷酸代替原先无放射性的核苷酸， 将放射性同位素 掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为
!"!
!" #$% #$ 用双链探针杂交验测另一个远缘 ()* 时，探针
’"I’"" 个核苷酸。
随机引物法是近年来发展起来的一种较理想的 标记方法， 具有操作简便、 标记活性高、 适用范围广等 特点， 有取代切口平移法标记 ()* 探针的趋势。 其原 理是随机引物（ 一般指含有各种排列的寡核苷酸片段 的混合物， 此混合物可人工合成， 一般长度为 J 个核 作为合成新 苷酸残基） 能与各种单链 ()* 模板结合， 链的引物， 在 ()* 聚合酶的催化下， 遵循碱基互补原 其核苷酸顺 理， 按 ’H!$H 方向合成一条新的 ()* 链， 序与模板 ()* 完全互补。另一单链 ()* 模板分子， 同样合成一条新的完全互补的 ()* 链。在反应体系 中加入 K 种 2)30，其中一种带放射性核素标记的核 使 苷酸， 在合成反应中掺入到新合成的 ()* 分子中， 合成的 ()* 带有放射性核素。 反应结束后， 经纯化即 可得到标记好的 ()* 探针。该法标记化合物掺入率 高达 L"E#M"E 。 双链 ()* 探针在与靶序列杂交前， ()* 分子必 须变为单链， 这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链 ()* 分子被迅速冷却到只能缓慢复性的 温度以下， 可使探针保持单链状态。
?2> 等。
核酸探针具有特定的序列， 能够与具有相应核苷 酸碱基互补序列的核酸片段结合， 因此可用于样品中 特定基因片段的检测。
１ 核酸探针的标记物 *+, XYZ[;
放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广 泛的探针标记物。常用的同位素有 @ 、 A 、 ) 。其中，
4! 4 47
以 @ 应用最普遍。
关键词
&’( 78 中图分类号 95:;
<
核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记 物（ 如酶与荧光素等） 标记的 =2> 片段、 单链 =2> 和
已知每个生物体的各种性质和特征都是由其所 含的遗传基因所决定的，例如一种微生物的病原性 就是由于这种微生物含有并表达了某个或某些有害 的基因而产生的。从理论上讲， 任何一个决定生物体 特定生物学特性的 =2> 序列都应该是独特的。如果 将 某 一 种 微 生 物 的 特 征 基 因 =2> 双 链 中 的 一 条 进 行标记，例如用 4!@ 同位素标记，即可制成 =2> 探 针。由于 =2> 分子杂交时严格遵守碱基互补配对的 原则， 通过考查待测样品与标记性 =2> 探针能否形 成杂交分子， 即可判断样品中是否含有此种微生物， 并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物 数量。
４
核酸探针的应用前景 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、 遗
传病的产前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面 以及特异性目的基因及外源 ()* 的检测方面，核酸 探针技术将越来越显出其巨大的应用前景。
参考文献： ［ !］ 刘 妙 良 N 地 高 辛 配 基 标 记 的 核 酸 技 术 N 生 物 化 学 和 生 物 物 理进展， !OO,， !O ： $KN ［ 杨盛昌 N 基因工程N 北京： 科学出版社 "",N ,］ 楼士林， ［ 中国科学技术出版 $］ 林万明 N 核酸探针杂交实验技术 N 北京： 社， !OO!N ［ 聂刘旺 N 基因工程N 北京： 科学出版社 ""’N K］ 刘祥林，
M
$,
由 456789 片段作用合成放射标记探针，反应完毕后 得到的是部分双链分子。 在克隆序列内或下游用限制 性内切酶切割这些长短不一的产物， 然后通过变性凝 胶电泳（ 如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） 将探针与模板 分离开。双链 +: 型 -!$()* 也可用于单链 ()* 的 制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探 针。 （ 用反转录酶合成单链 ;()* ,）以 +)* 为模板， 探针。;板合成 ;()* 探针所用的引 物有下列 , 种。 为引物合成 ;()* 探针。本方法 ! 用寡聚（ 23 ） 只能用于带 085< （ 的 =+)* ， 并且产生的探针极大 *） 多数偏向于 =+)*$> 末端序列。 " 可用随机引物合成 ;()* 探针。该法可避免 上述缺点， 产生比活性较高的探针。但由于模板 +)* 中通常含有多种不同的 +)* 分子，所得探针的序列 往往比以克隆 ()* 为模板所得的探针复杂很多， 应 预先尽量富集 =+)* 中的目的序列。 反转录得到的产物 +)* ? ()* 杂交双链经碱变 性后， 经 +)* 单 链 可 被 迅 速 地 降 解 成 小 片 段 ， @6&A.26BC1’" 柱层析即可得到单链探针。
!"&
பைடு நூலகம்
%" #$% #$ 双链 ()* 探针的合成方法主要有下列 , 种： 切
口平移法和随机引物合成法。 切口平移法是目前实验室中最常用的一种 ()* 探针标记方法，用此法标记的核苷酸的掺入率可达
,"D#$"E 。其原理是利用 ()* 聚合酶 F 能修复 ()* 链的功能。方法是先由 ().G6! 在双链 ()* 分子的 一条链上产生切口，这样 !"#$%& ()* 聚合酶 F 就可 将核苷酸连接到切口的 $H 羟基末端。同时该酶具有 从 ’H!$H 的核酸外切酶活性，能从切口的 ’H 端除去 核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的 $H 端 用放射性 补上核苷酸， 从而使切口沿着 ()* 链移动，
酶在插入片段中某一适当部位或插入片段下游的某 一部位消化重组质粒， 使之成为线性 =2> ， 然后在相 以含有目的基 应的 =2> 依赖性 ?2> 聚合酶催化下， 因的 =2> 片段为模板合成 ?2> 探针。
２
核酸探针检测的原理 核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交， 其工作
或!条 原理是碱基配对， 即 ! 条碱基互补的 =2> 链（ 碱基互补的 =2> 链和 ?2> 链） 在适当条件下可以按 碱基配对原则， 形成杂交 =2> 分子。
序列与被检测序列之间有很多错配，但是， , 条探针 互补链之间的配对却十分稳定， 即形成自身的无效杂 交， 结果使检测效率下降。科学上采用单链探针则可 解决这一问题。单链 ()* 探针的合成方法主要有下 列 , 种： （ !）从 -!$ 载体衍生序列合成单链 ()* 探针。 合成单链 ()* 探 针 可 将 模 板 序 列 克 隆 到 -!$ 噬 菌 体载体中， 以此为模板， 以特定的通用引物或以人工 合成的寡核苷酸为引物， 在［ ./ 0］ 12)30 的存在下，