纤维素酶的检测方法
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法,诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致.
单位酶活的计算:
n：稀释倍数；
K:曲线斜率；
T：反应时间，min；
1000：mg换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》(夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》(刘妙莲等，中国食品发酵
工业研究所)这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索,进而优化实验方法.。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
分光光度法测定纤维素酶酶活
分光光度法测定纤维素酶酶活1适用范围本方法适用于纤维素酶酶活的测定。
2测定原理纤维素酶在一定温度与pH条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产3-氨基-5-硝基水杨酸。
其产生物在煮沸条件下，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解纤维素产生1μg还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1柠檬酸缓冲液（pH=5.0）磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。
柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至100ml。
取上述配制的磷酸氢二钠溶液24.3ml、柠檬酸溶液25.7ml混匀即为柠檬酸缓冲液，其pH值为5.0。
4.2羧甲基纤维素溶液（CMC溶液）称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200ml水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液100ml，加柠檬酸缓冲液20ml，蒸馏水40ml，混匀，储存于4℃条件下备用。
4.33,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂）称取3,5-二硝基水杨酸6.3g加入到约600ml水中，逐渐加入氢氧化钠20.8g，在50℃的水浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠182g，苯酚5g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。
滤液储存于棕色瓶中暗处放置7天后使用。
4.4标准葡萄糖溶液（1mg/mL）准确称取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸馏水中，定溶至250ml。
纤维素酶活力的测定
实验5纤维素酶活力的测定一、原理：纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
二、试剂：1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、测定方法：1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于40度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
取糖化液１毫升，按制标准曲线时一样加显色液比色。
同时以１毫升煮沸的酶液代替酶做一空白对照。
四、计算：在上述条件下，1毫克酶每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。
N *OD值对应的葡萄糖量纤维素酶活力单位＝——————————————３０*１N---酶液的稀释倍数３０――糖化所用时间１――反应酶液毫升数。
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法纤维素酶是一种广泛存在于自然界中的酶类，具有重要的降解纤维素的功能。
对于工业生产、环境保护及生物能源等领域都有着极为广泛的应用。
因此，纤维素酶的测定方法也越来越受到研究者的关注。
本文将针对纤维素酶的三种活力测定方法进行详细介绍。
一、滴定法滴定法是最为简单、传统的纤维素酶活力测定方法。
其操作步骤相对较简单，但由于其受试物中的葡萄糖数量较小，因此准确度不如其他测定方法。
滴定法的具体操作步骤如下：1.采用苯酚褐或者硫酸铜-硫氰化钾将葡萄糖转化为光滑葡萄糖2.使用离子交换树脂净化试样3.通过酸水解，将可分离出的光滑葡萄糖转化为葡萄糖4.通过NaOH溶液中添加试样，测定试样所需要的NaOH溶液的体积二、反向相色谱法反向相色谱法是一种基于色谱技术的测定方法。
比滴定法更加准确且可靠。
反向相色谱法可以通过改变样品与固相载体的交互时间，实现对样品组分的分离。
其操作步骤如下：1.使用有机溶剂混合纤维素样品2.净化溶液，分离部分有机溶剂和水3.试样在反向相色谱柱上，随柱子流动4.通过检测器检测滴量，确定样品的浓度三、淀粉-纤维素显色法淀粉-纤维素显色法是一种基于酶法和化学显色技术结合的测定方法。
其同时测定酶反应的数量和反应的速率，可以获得相对准确的数据。
具体操作过程如下：1.样品中的淀粉与纤维素同时与碘反应2.通过求字头光度的变化及测试时间的变化，测定酶的活力3.以酶动力学为基础，通过数据分析得到相应的酶反应速率总结起来，以上三种方法均可用于纤维素酶的活力测定。
针对不同的需求，可以选择适当的方法进行测定。
其中，受试物的纯度和净化程度是影响精度的关键因素，因此在测定前要进行适当的纯化。
在生产过程中，可以选择淀粉-纤维素显色法作为主要测定方法，以保证产物质量的稳定性和可控性。
dns法测定纤维素酶活力原理
dns法测定纤维素酶活力原理纤维素酶，这个名字听起来就像高大上的科学词汇，其实它在咱们的日常生活中可是大有来头。
想想看，咱们的衣服、纸张，甚至一些食品里，都和它有着千丝万缕的联系。
说白了，纤维素酶就是一种能把纤维素这个“大块头”分解成小分子的“超级英雄”。
要不然，这些纤维素可真是“难啃的骨头”，光靠我们自己的牙口可没法啃下去。
所以，这种酶的活力就显得尤为重要了。
现在，咱们来聊聊用DNS法测定纤维素酶活力的原理，听起来有点复杂，其实也并不难，咱们慢慢道来。
DNS法其实就是一种颜色变化法。
嘿，你没听错，颜色变化！你想啊，咱们日常生活中，很多东西都是通过颜色来判断的，比如熟不熟、甜不甜，甚至是“这件衣服合不合适”。
所以，这个方法就是借助颜色变化，来观察纤维素酶的活力到底有多强。
这里的“DNS”指的是一种化学试剂，名字比较长，不想说了，简单点，叫它“变色剂”就行。
这个“变色剂”能跟分解后的纤维素反应，形成一种深红色的物质。
就像调色板上的颜色，越深的颜色，说明分解得越彻底，酶的活力就越强。
这个过程是怎么发生的呢？想象一下，纤维素在水中，纤维素酶像一个勤劳的小工人，正在不停地工作。
它一边“啃”着那些纤维素，一边把分解出来的小分子释放到水里。
好比咱们吃饭，吃了一口又一口，最后把盘子清理得干干净净。
然后，DNS法就是通过测量水里的颜色来评估纤维素酶的工作效率。
颜色越深，酶的活力越高，反之，颜色浅，就说明这位小工人可能今天状态不佳，干得不够。
可能有人会问，咱们为什么要关心纤维素酶的活力呢？这可是个好问题。
因为纤维素酶在许多行业里都有广泛的应用，比如说造纸、酿酒，甚至在生物燃料的生产中，都是不可或缺的“好帮手”。
如果咱们知道它的活力，就能调整工艺，优化生产，省时又省力，简直就是为生产效率加了一把火。
说说这个DNS法的操作步骤。
咱们得准备好一堆材料，包括纤维素、酶、还有那个神秘的“变色剂”。
然后，把纤维素和酶混合，放到特定的温度下，让它们好好亲密接触。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
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530nm比色。
2、酶活测定方法：
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考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
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测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
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根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。
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纤维素酶测定方法
纤维素酶测定方法纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，广泛应用于生物质降解、生物燃料生产、食品加工和纸浆制造等领域。
纤维素酶的测定方法可以用来评估纤维素酶的活性，指导纤维素酶的生产和应用。
目前，纤维素酶的测定方法主要包括分光光度法、滴定法、高效液相色谱法等多种方法。
分光光度法是一种常用的纤维素酶测定方法，其原理是利用纤维素酶对纤维素底物的降解作用，使纤维素底物溶液中产生可被分光光度计检测的产物。
一般情况下，纤维素酶的活性与产物的浓度成正比。
因此，通过测定产物的浓度，可以间接反映纤维素酶的活性。
这种方法简便易行，结果可靠，因此在实际应用中得到广泛应用。
滴定法是另一种常用的纤维素酶测定方法，其原理是利用纤维素酶对纤维素底物的降解作用，使底物溶液中的某种物质产生变化，然后用滴定法来定量测定底物中该物质的含量。
常用的滴定法有碘滴定法和二硫蒽滴定法。
这种方法操作简单，结果准确，适用于测定不同类型的纤维素酶。
高效液相色谱法是一种高灵敏度、高精确度的纤维素酶测定方法。
其原理是利用高效液相色谱仪对纤维素底物和产物进行定量分析。
该方法对底物和产物的特异性较大，结果准确可靠。
然而，该方法操作复杂，设备昂贵，一般只在科研实验室中使用。
除了上述常用的纤维素酶测定方法，还有一些其他方法可以用于测定纤维素酶活性，如放射性同位素法、荧光法、电化学法等。
这些方法都具有一定的优点和局限性，可以根据具体实验目的和条件选择合适的方法。
总的来说，纤维素酶的测定方法多种多样，每种方法都有其自身的特点和适用范围。
在实际研究和应用中，应根据实验目的、所需结果的精确度和灵敏度等因素选择合适的方法。
此外，不同的纤维素酶可能对不同的测定方法具有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行优化和改良。
未来，随着科学技术的发展，纤维素酶测定方法也会越来越完善，为纤维素降解和利用提供更好的技术支持。
四种纤维素酶酶活测定方法的比较
四种纤维素酶酶活测定方法的比较一、本文概述纤维素酶是一类能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，它们在生物降解纤维素以及纤维素类物质的转化利用中发挥着至关重要的作用。
由于纤维素酶在纺织、造纸、生物燃料、食品工业等多个领域的广泛应用，对其酶活性的准确测定就显得尤为重要。
本文旨在比较四种常用的纤维素酶酶活测定方法，包括滤纸酶活法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活法、对硝基苯酚纤维二糖法（pNPC）和荧光底物法，以期为读者提供一个全面而深入的理解，帮助研究者根据实验需求选择合适的测定方法。
本文将首先简要介绍纤维素酶的重要性和应用领域，然后详细阐述这四种酶活测定方法的原理、操作步骤、优缺点以及适用范围。
通过对比这些方法的灵敏度、准确性、重现性、操作简便性等方面，我们将为读者提供一个清晰的方法选择指南。
本文还将讨论影响酶活测定准确性的因素，并提出相应的改进措施，以期提高纤维素酶酶活测定的准确性和可靠性。
我们将对纤维素酶酶活测定方法的未来发展趋势进行展望，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
二、方法介绍纤维素酶是一种能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，其酶活测定对于了解纤维素酶的性质、优化酶的生产工艺以及评估其在各种工业应用中的效率至关重要。
目前，常见的纤维素酶酶活测定方法主要包括滤纸酶活测定法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法、还原糖法以及荧光底物法。
滤纸酶活测定法：此方法是基于纤维素酶对滤纸的水解能力。
在一定条件下，纤维素酶将滤纸水解成还原糖，通过比色法或滴定法测定还原糖的含量，从而推算出纤维素酶的活性。
该方法操作简单，但受滤纸质量、实验条件等因素影响，结果可能存在一定误差。
羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法：该方法以羧甲基纤维素钠为底物，通过测定酶解后释放的还原糖量来计算纤维素酶的活性。
该方法具有底物纯度高、反应条件易控制等优点，因此在许多研究中得到广泛应用。
然而，CMC与天然纤维素的结构差异可能导致测定的酶活与实际应用中的酶活不完全一致。
纤维素酶活力的测定实验报告
纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。
2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。
本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。
具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。
3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。
（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。
（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。
（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。
（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。
4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。
5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。
这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。
6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。
这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。
在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。
纤维素酶的检测方法新
纤维素酶的检测方法新-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。
据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。
大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。
所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。
自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。
目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。
C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。
Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。
Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。
Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为 5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖 1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠 1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为 5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸 1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离 5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚 2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取 5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离 5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至 5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取 2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入 2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取 2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入 2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×ｔ式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD?Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
纤维素酶酶活测定
纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
空白对照用酶活的酶液作对照。
(完整版)纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶测定方法
纤维素酶测定方法
1、纤维素酶活的测定采用DNS法，,即首先以葡萄糖的μmoL数为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。
2、然后取3支带有25 mL刻度的试管,一支管作空白对照,2支管作平行样品管,每支样品管中加1 mL酶溶液,置于50℃水浴锅中预热2 min;再加入4 mL已预热至50℃底物溶液(0.625 g CMC溶于100mL pH4.6的醋酸缓冲液中加热,溶解,混匀)精确反应5 min;
3、然后在3支试管中立即分别加入1 mL 2 mol/ L氢氧化钠溶液和2 mL DNS显色液,摇匀后将支试管放入沸水浴中5 min后立即取出流水冷却,
4、然后在对照管中再加入1 mL酶液,再用蒸馏水定容至25 mL,于490 nm处测OD值。
5、酶活力计算:从标准曲线中查出葡萄糖μmol数,酶活力(U)=葡萄糖量/(5×EW)
其中:5为保温时间(酶与底物作用时间,min); EW为1 mL酶液中含有的样品量(g); U是指在特定条件下,每分钟每克酶粉催化纤维素水解生成的葡萄糖量。
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纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
1.纤维素CMC酶
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用。
3.0原理
纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0试剂
4.1无水醋酸钠(分析纯)
4.2冰醋酸(分析纯)
4.3 3.5－二硝基水杨酸
4.4无水葡萄糖
4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
4.6氢氧化钠(分析纯)
4.7重蒸苯酚(分析纯)
4.8无水亚硫酸钠(分析纯)
4.9叠氮化钠(分析纯)
4.10羧甲基纤维素钠
5.0仪器
5.1水浴锅(恒温)50±1℃
5.2电热干燥箱80±1℃
5.3 722型分光光度机计
5.4分析天平感量0.1㎎
5.5一级玻璃制品
5.6电冰箱
6．0试剂的准备
6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:
溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7．0标准曲线制作：
7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。
7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
7.3标准葡萄糖曲线制作
取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS 试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。
由光密度值引得葡萄糖量。
8.0 CMC酶活性测定。
8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。
8.2分析程序：
取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml 摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm 下测OD值。
9.0计算活力单位
A×D×5×1000
CMC酶活力=————————µ/g(ml)
30
A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）
D：酶粉（液）稀释倍数
2.FPA酶
即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素，释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成正比关系。
通过在550NM的光吸收值查对标准曲线，可以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。
3.半纤维素酶：
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用
3.0原理
半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
4.0单位定义
一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
5.0试剂
5.1无水醋酸钠（分析纯）
5.2冰醋酸（分析纯）
5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）
5.4木糖（分析纯）
5.5四水酒石酸钾钠（分析纯）
5.6氢氧化钠（分析纯）
5.7重蒸苯酚（分析纯）
5.8无水亚硫酸钠（分析纯）
5.9叠氮化钠（分析纯）
5.10木聚糖（分析纯）
6.0仪器
6.1水浴锅（岳阳家政恒温）50±1℃
6.2电热干燥箱80±1℃
6.3 772型分光光度计
6.4分析天平感量0.1
6.5一级玻璃制品
6.6电冰箱
7.0试剂的制备：
7.1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml配成0.1MNaNC溶液。
溶液B：称取8.2gNaAC，溶解后容至1000ml，制成0.1MNaAC溶液。
使用溶液以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
7.2 DNS试剂
溶液A：称分析纯NaoH104g，溶于1300ml水中，加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
B：称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
7.3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。
8.0标准曲线制作：
8.1木糖80℃烘干至恒重。
8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
8.3标准木糖曲线制作
取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml，加入2.0mlDNS 试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。
9.0半纤维素酶活性测定；
15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml（三支平行样），再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液，摇匀，50℃水溶60分钟，排毒养颜胶囊取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10分钟，冷却后，补加水定容到15ml，轻轻上下摇匀，空白用0.2ml稀释酶液加。
1.8ml醋酸缓冲液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。
10.0计算活力单位:
半纤维素酶活力=(A×D×5×1000)÷60 u/g(ml)
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)
D:酶粉(液)稀释倍数。