02地衣芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
活菌数的测定方法
活菌数的测定方法
一、直接计数法：
1.显微镜计数法：将样品通过适当稀释后涂布在平板上，然后在显微
镜下直接观察，将显示出的活菌数量进行计数。
2.罗氏计数室法：将适当稀释后的样品放在罗氏计数室中，通过显微
镜下观察菌落数并计数，然后根据稀释倍数计算活菌数。
3.涂布法：将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上，在适宜温度下培
养一段时间，然后观察并计算菌落的数量。
二、间接计数法：
1.白细胞计数法：用白细胞计数板进行白细胞计数，由于白细胞数与
活菌数有一定的相关性，可以通过白细胞计数的结果进行推算。
2.生物标志物法：通过检测样品中特定的生物标志物，如ATP、葡萄
糖等，间接反映出活菌的数量。
3.代谢产物测定法：通过测定样品中的代谢产物（如氧气消耗量、二
氧化碳产生量等），间接推测出活菌的数量。
以上是常见的活菌数测定方法，不同的方法适用于不同的实际应用场景。
在选择测定方法时，需要考虑样品类型、检测目的、测定时间和精确
度等因素。
另外，为了提高测定结果的准确性，还需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养时间等。
最后，需要注意的是，活菌数的测定方法只能提供大致数量，无法直
接得到准确的数值。
因此，在进行活菌数测定时，需要结合其他的检测方
法和数据进行综合分析。
地衣芽孢杆菌的计算实验报告
地衣芽孢杆菌的计算实验报告地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，它具有多种生理特性和广泛的应用价值。
为了深入了解地衣芽孢杆菌的特性和应用潜力，我们进行了一系列的计算实验。
本报告将详细介绍我们的实验设计、方法、结果和讨论。
一、实验设计我们的实验目标是研究地衣芽孢杆菌的生理特性和应用潜力。
为了达到这个目标，我们设计了以下几个实验内容：1.生长曲线实验：通过测量地衣芽孢杆菌在不同培养时间下的菌落数量，绘制生长曲线，以了解其生长速度和最适生长条件。
2.产酶实验：地衣芽孢杆菌具有多种产酶能力，我们将通过测定其产酶的能力和活性，探究其在生物降解、发酵和制药等方面的应用潜力。
3.抗菌活性实验：地衣芽孢杆菌被广泛应用于抗菌剂的生产，我们将评估其产生的抗菌物质对不同病原菌的抑制效果，为其在医药领域的应用提供参考。
二、实验方法1.生长曲线实验：我们在不同培养基中培养地衣芽孢杆菌，并每隔一段时间测量菌落数量。
通过绘制菌落数量与培养时间的关系曲线，得到生长曲线。
2.产酶实验：我们选取几种常见的酶，如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，将地衣芽孢杆菌接种到含有特定底物的培养基中，培养一段时间后，通过测定底物的降解程度和酶的活性，评估其产酶能力。
3.抗菌活性实验：我们选取几种常见的病原菌，如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，将地衣芽孢杆菌培养产生的抗菌物质与这些病原菌接触，观察并比较其抑菌效果。
三、实验结果1.生长曲线实验结果显示，地衣芽孢杆菌在适宜温度和培养基条件下，呈现出典型的生长曲线，包括潜伏期、对数增长期和平台期。
最适生长温度为30℃，最适培养基为LB培养基。
2.产酶实验结果显示，地衣芽孢杆菌具有较高的产酶能力，尤其在淀粉酶和纤维素酶方面表现突出。
其产酶活性随培养时间的增加而增强，最适培养时间为48小时。
3.抗菌活性实验结果显示，地衣芽孢杆菌产生的抗菌物质对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制效果。
地衣芽孢杆菌活菌颗粒检测标准
地衣芽孢杆菌活菌颗粒检测标准
地衣芽孢杆菌活菌颗粒检测标准主要包括以下几个方面：
1. 外观：应呈浅黄色颗粒状，无明显杂质。
2. 微生物限度：每克颗粒中应含有不少于亿个地衣芽孢杆菌活菌。
3. 安全性检测：如急性毒性、长期毒性等，以确保产品安全。
4. 稳定性检测：检查产品在不同温度、湿度等条件下的稳定性。
5. 卫生指标：如铅、砷、汞等有毒物质含量，应符合相关卫生标准。
6. 质量标准研究：确定产品的质量标准，包括颗粒大小、水分、pH值、干燥失重等指标。
7. 药效学研究：研究地衣芽孢杆菌活菌颗粒的药效学性质，以评估其治疗效果。
8. 药代动力学研究：研究地衣芽孢杆菌活菌颗粒在人体内的吸收、分布、代谢和排泄情况。
9. 临床试验：进行临床试验，以评估地衣芽孢杆菌活菌颗粒的有效性和安全性。
请注意，这些标准仅为一般性指导，具体检测标准可能会因不同的生产商、产品类型和用途而有所不同。
在实际操作中，还需参考相关法律法规和产品说明书，以确保准确、安全地检测地衣芽孢杆菌活菌颗粒。
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法1主题内容与适用范围本方法规定了芽孢杆菌总数的测定方法；本方法适用于测定微生物制剂中芽孢杆菌总数2方法提要芽孢杆菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。
按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的芽孢杆菌菌落总数。
3培养基与试剂3.1营养琼脂成分蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，琼脂20g，水1000mL。
3.2制法:将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2，分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。
4仪器高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，培养箱，36±1℃，电炉，天平，冰箱，pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。
5活菌计数方法5.1取固体样品5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min。
5.2用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。
5.3吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。
5.4涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。
6菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。
地衣芽孢杆菌(农业种植用)
【主要成分】
地衣芽孢杆菌及其代谢产物，适宜载体。
【活菌含量】
1000亿/g
【产品特点】
1、地衣芽胞杆菌以芽孢形式存在，抗逆性强，耐受高温、高压等苛刻制粒条件；
2、地衣芽孢杆菌活菌数高，复活迅速，短时间内形成优势菌群；
3、地衣芽孢杆菌生物活性强，代谢物丰富；
4、地衣芽孢杆菌添加成本低、效果显著；
5、地衣芽孢杆菌无毒副作用、无耐药性、无残留，高效环保。
【产品功效】
1、能产生多种活性物质，刺激作物生长。
2、产生多种抗菌物质，抑制土壤放线菌，应用于植物病害防治。
3、促进植物免疫系统发育,提高植物抗病能力;
4、降解农药残留
【作用机理】
1、可代谢分泌短杆菌肽、多帖菌素、制霉菌等多种抗菌物质，可抑制葡萄球菌、白色念球菌、酵母样菌等致病菌生长繁殖。
2、地衣芽胞杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解非淀粉多糖的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素等酶，可提高蛋白质和能量利用率，促进种植农作物的生长。
3、地衣芽胞杆菌促进植物机体免疫器官的生长发育和成熟，激活免疫因子，刺激植物体的免疫应答，提高免疫功能。
【用法用量】
建议每吨有机肥添加1000g-2000g。
【注意事项】
1、地衣芽胞杆菌全期使用最佳，使用时注意混合均匀，植物患病期间使用剂量
可酌情增加。
2、地衣芽胞杆菌在使用过程中，避免与消毒及抗菌药物一起使用。
【产品规格】
保质期：24个月
包装规格：25KG／袋
地衣芽胞杆菌应置于阴凉干燥处，避免与有毒、有害物质混合存放，开包后应短期内用完。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
地衣芽孢杆菌活菌说明书
地衣芽孢杆菌活菌说明书地衣芽孢杆菌活菌是一种生物农药，广泛用于农田、果园和花卉园艺中的病虫害防治。
本说明书将详细介绍地衣芽孢杆菌活菌的特点、使用方法以及防治效果等相关信息，以供用户参考。
一、地衣芽孢杆菌活菌的特点1. 杀灭害虫：地衣芽孢杆菌活菌具有较强的杀虫能力，可有效控制多种害虫，如蚜虫、红蜘蛛、蚧壳虫等。
它通过产生抑制酶、杀菌素和毒素等方式对害虫进行干扰和消灭。
2. 抑制病菌：地衣芽孢杆菌活菌还能抑制多种病原菌的生长繁殖，如根腐菌、霜霉菌等。
它能够与病原菌竞争营养物质，产生对病原菌有害的物质，从而减少病害的发生。
3. 对环境友好：地衣芽孢杆菌活菌是一种天然菌株，不会对环境造成永久性污染。
使用地衣芽孢杆菌活菌可以减少对化学农药的依赖，降低农业对环境的负担。
二、地衣芽孢杆菌活菌的使用方法1. 施用时间：地衣芽孢杆菌活菌适用于作物生长期的不同阶段。
一般来说，防治病害可在病害初期施用，防治害虫可在害虫孳生期和繁殖高峰期施用。
2. 施用剂量：地衣芽孢杆菌活菌的施用剂量根据作物类型、病虫害类型和严重程度而定。
建议按照包装标签上的使用指南施用，遵守田间化学农药使用原则，避免过量使用。
3. 施用方法：地衣芽孢杆菌活菌可以通过叶面喷洒、土壤灌溉等方式施用。
具体施用方法可以根据作物类型和作物受害情况而定，使用前应进行必要的稀释和混合。
三、地衣芽孢杆菌活菌的防治效果地衣芽孢杆菌活菌作为一种生物农药，经过多年的研究和实践验证，在病虫害防治中展现出较好的效果。
1. 控制病害：地衣芽孢杆菌活菌可以有效控制多种病害，如根腐病、霉菌病等。
它通过与病原菌竞争营养物质，产生抑制物质来减少病害的发生。
长期使用地衣芽孢杆菌活菌可以降低病菌的种群密度，减少病害的发生。
2. 防治害虫：地衣芽孢杆菌活菌对多种害虫有明显的防治效果。
它通过干扰害虫的正常生理代谢，杀灭害虫的幼虫和卵，从而控制害虫数量。
与化学农药相比，地衣芽孢杆菌活菌具有较低的副作用和成本。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、实验器材准备1.带有盖子的培养皿2.加满蒸馏水的试管3.注射器及针头4.培养基、琼脂、葡萄糖、干燥棉签5.无菌铲子6.无菌尖嘴瓶7.显微镜、移液器、平板振荡器等二、样品的采集和处理1.选择代表性的土壤样品，并在24小时内用无菌探针采集5个不同位置的样品。
2.将每个样品混合均匀，取适量的土壤放入无菌容器准备使用。
三、菌液的制备1.取一个含有褐青素盐琼脂（PDA）培养基的无菌尖嘴瓶，将葡萄糖加入培养基中，按照比例加入适量的样品。
2.将培养基瓶密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，杀死培养基中的已有细菌。
3.灭菌后将培养基倒入带有高度透明度的培养皿中，使其凝固。
四、制备样品的稀释液1.用蒸馏水装满试管。
2.将试管密封并用高压灭菌器进行高温高压灭菌，避免试管中的无菌水受到外界污染。
五、稀释菌液1.使用无菌针头在凝固的培养皿上划线。
2.采用无菌技术，将针头刺入活菌样品中，然后点在琼脂上。
3.在培养皿上划线的其他位置也同样操作。
4.将培养皿倒置在25°C温度下放置24-48小时，直到菌落生长到适当大小。
六、菌液的计数1.使用无菌铲子在菌落上刮取一小段。
2.将刮取物重新悬浮在无菌试管中。
3.按照适当的比例将菌液和蒸馏水混合，制备一系列的稀释液。
4.取稀释液的适量放在培养皿中，使其均匀覆盖整个琼脂表面。
5.将培养皿密封并放置在25°C下培养3-5天。
6.在培养皿上观察并计数活菌数量。
七、结果的统计和计算1.统计每个培养皿上的活菌数目，计算平均值。
2.根据样品的稀释倍数、培养皿中的活菌数目和悬液中的总体积，计算出每克样品中活菌的数量。
八、数据记录和分析1.将实验过程中的数据记录清晰，并进行相关的数据分析和比较。
2.结果的可靠性可以通过加入对照组进行验证，确保实验结果的准确性。
九、实验安全注意事项1.在实验过程中要严格遵守无菌操作的原则，避免外界污染。
2.注意实验室卫生，保持实验环境整洁。
地衣芽孢杆菌的检测方法
地衣芽孢杆菌的检测1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
1.1恒温培养箱：37℃±1℃。
1.2冰箱：2℃～5℃。
1.3天平：感量为0.1g。
1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。
1.5振荡器。
1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。
1.8无菌培养皿：直径90mm。
1.9显微镜：10倍～100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.11恒温水浴箱80℃±1℃。
2、培养基和试剂2.1 营养琼脂培养基2.1.1 营养琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 琼脂16.0g 蒸馏水1000mL 2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.2营养肉汤培养基2.2.1营养肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏3.0g 氯化钠5.0g 蒸馏水1000mL2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.2±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
2.4.2革兰氏碘液2.4.2.1 成分碘1g 碘化钾2g 蒸馏水300mL2.4.2.2 制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后再加蒸馏水至300mL。
地衣芽孢杆菌活菌说明书
地衣芽孢杆菌活菌说明书地衣芽孢杆菌，学名Bacillus subtilis，是一种广泛存在于自然界中的细菌。
它具有多种特殊功能和广泛的应用价值，被广泛用于农业、食品工业、环境保护等领域。
地衣芽孢杆菌具有很强的耐受性，能在各种环境条件下生存繁殖。
它可以在低pH环境下生活，还能耐受高温、低温、极端干旱等条件。
这使得地衣芽孢杆菌在农业上的应用非常适合。
地衣芽孢杆菌在农业领域中有着广泛的应用。
首先，它可以作为一种生物农药来控制多种农业害虫。
地衣芽孢杆菌产生的特殊物质可以干扰病虫害的生命周期，达到防治的效果。
其次，地衣芽孢杆菌还可以改善土壤环境，促进植物生长。
它可以分解有机质，释放有益元素，提供植物所需的养分，增加土壤的肥力。
此外，地衣芽孢杆菌还被广泛应用于食品工业。
它可以防止食品腐败，延长食品的保质期。
地衣芽孢杆菌产生的抗菌物质可以有效抑制各种食品腐败菌的生长，保持食品的新鲜和卫生。
在环境保护领域，地衣芽孢杆菌也发挥着重要的作用。
它可以分解有机化合物、污水和油污等环境污染物，将其转化为无害的物质，起到净化环境的作用。
此外，地衣芽孢杆菌还可以吸附重金属离子，降低水体和土壤中重金属的污染程度，保护环境和生态系统的健康。
对于地衣芽孢杆菌的使用，有一些操作注意事项。
首先，在使用地衣芽孢杆菌前，需要仔细阅读产品说明书，并按照说明进行保存和使用。
其次，地衣芽孢杆菌应在适宜的温度、湿度和pH条件下保存。
再次，使用地衣芽孢杆菌时，要注意与其他化学农药的配合使用，以避免不必要的化学反应和副作用。
最后，使用地衣芽孢杆菌时，要注意个人防护措施，以免对身体造成不良影响。
总结来说，地衣芽孢杆菌作为一种广泛应用的细菌，具有抗虫、促进植物生长、防腐保鲜、环境净化等多种功能。
它的使用需要注意操作事项，并且应合理配合其他农药和化学物质。
地衣芽孢杆菌的应用将为农业、食品工业和环境保护等领域提供有效的解决方案。
大肠杆菌活菌数含量的测定操作规程
大肠杆菌活菌数含量的测定操作规程1. 引言大肠杆菌是一种常见的细菌，在食品、水源和环境中广泛存在。
测定大肠杆菌的活菌数含量对于食品安全、水质检测和环境卫生监测具有重要意义。
本文档旨在规范大肠杆菌活菌数含量的测定操作流程。
2. 设备和试剂准备- 培养基：LB培养基- 培养物：已经培养好的含有大肠杆菌的培养物- 烧杯、移液器、试管、平皿等常用实验室器材- 紫外灯或显微镜3. 测定操作步骤1. 准备样品：将待检样品按照指定方法进行采样，保持样品的完整性和代表性。
2. 样品处理：将样品转移到烧杯中，并进行适当的稀释，以保证菌落计数的准确性。
3. 制备培养基：按照LB培养基的配方准备培养基，在适当的温度下热化并均匀混合。
4. 接种培养基：将适量的样品接种到LB培养基中，通过摇床或培养箱进行培养，时间和培养条件根据需求确定。
5. 培养时间：根据实验需求，在适当的温度下，在摇床或培养箱中进行长时间培养。
6. 菌落计数：将培养的菌液制成适当的稀释液，然后取适量的菌液在平皿中均匀涂布，放置在恒温箱中进行菌落生长。
菌落生长后，使用显微镜或紫外灯统计菌落数量。
7. 结果记录：将统计得到的菌落数量记录下来，并计算大肠杆菌的活菌数含量。
4. 结果处理和数据分析1. 根据菌落计数的结果计算出大肠杆菌的活菌数含量。
2. 将结果与相应的标准进行对比，评估样品的卫生质量。
5. 结论本操作规程能够规范大肠杆菌活菌数含量的测定操作流程，为食品安全、水质检测和环境卫生监测提供准确可靠的数据依据。
6. 参考文献（列出参考文献，如有需要）。
芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
目的：建立芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：QC内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、吐温80等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入30ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，再加入60ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×101稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3 用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液1ml，加至已灭菌的平皿中，再加入50℃左右的培养基，向每个培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后，倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数： 5.1 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
5.3若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数。
芽孢杆菌的检测方法
芽孢杆菌的检测方法韩雪;张兰威【摘要】内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构.它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性,这与它的特殊结构有关.这种特性使其能经巴氏杀菌而残存于乳中,因此把芽孢数及耐热芽孢数、嗜冷菌作为原料奶检验项目之一,能较全面地评判原料奶的质量.根据芽孢的特性,本文对目前芽孢检测的各种方法进行了综述,以期为芽孢的快速检测提供依据.【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)001【总页数】4页(P347-350)【关键词】芽孢;原料乳;检测;2,6-吡啶二羧酸【作者】韩雪;张兰威【作者单位】东北农业大学食品学院,黑龙江,哈尔滨,150030;哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院,黑龙江,哈尔滨,150086【正文语种】中文【中图分类】工业技术347※专题论述食品科学2007, Vol.28, No.01[51]ANDREWS L S, PARK D L, CHEN Y P.Low temperature pasteuriza- tiontoreducetheriskofVibrioinfectionsfromrawshell-stockoysters[J].FoodAdditives andContaminants, 2000,19(7): 787.[52]CALIK H,MORRISSEY M T, RENO P, et al.Effect of high-pressure processing onVibrioparahaemoly ticusstrainsin pureculture and芽孢杆菌的检测方法韩雪1，张兰威2,*(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030 ；2.哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院，黑龙江哈尔滨150086)摘要：内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构。
它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性，这与它的特殊结构有关。
芽孢杆菌数量检测
微生物总数检测方法（芽孢杆菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基:配方：以北京路桥营养琼脂为例，按说明上配制需营养琼脂3.3克，水100毫升。
（尽量避免使用牛肉膏蛋白胨培养基）2. 培养条件：温度：33℃-37℃；时间：18--24小时。
二、检测与计数方法1. 梯度稀释取250ml锥形瓶一个，加入适量玻璃珠，100ml无菌水，3滴吐温80（分散剂：分散菌团用），塞上胶塞并放入到70℃水浴锅中预热，待锥形瓶中水温达到70℃后，称取适量样品加入锥形瓶中，摇匀，70℃水浴20分钟。
水浴结束后迅速冷却到30—40℃左右，上旋转式摇床200 r/min充分振荡40 min，即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行梯度稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。
3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1ml (菌悬液加入量)，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数以出现20—300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效菌平均菌落数（x）在20—300之间时，则以该菌落数计算。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：nm = x kv1/(mv2) ×10-8或 nv = x kv1/(vv2) ×10-8（1）式中：nm —质量有效活菌数，亿/gnv —体积有效活菌数，亿/mLx—有效菌落平均数，个k —稀释倍数v1—基础液体积， mLv2—菌悬液加入量， mLv—样品量，mLm—样品量， g重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。
地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定
中国畜牧兽医 2022,49(7):2812-2819C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Med i c i ne 地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定张 钰1,马 曦2,赵金标2,鲁 琳1(1.北京农学院动物科学技术学院,北京102206;2.中国农业大学动物科学技术学院,北京100193)摘 要:ʌ目的ɔ探究不同培养及发酵条件对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响及地衣芽孢杆菌19148的耐药性㊂ʌ方法ɔ设计单因素试验,分别在不同温度㊁酸碱度㊁金属离子㊁摇床转速㊁发酵时间和接种量的条件下培养地衣芽孢杆菌19148菌液,将培养后的菌液离心㊁过滤制成无菌滤液,并通过牛津杯抑菌试验探究无菌滤液对大肠杆菌K 88㊁鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌1882的抑制能力㊂通过药敏纸片法探究地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药的耐药性㊂ʌ结果ɔ地衣芽孢杆菌19148在4和75ħ下生长受到抑制,25㊁37和45ħ能正常生长,其中在37ħ抑菌活性最好㊂在p H5.0~9.0的条件下能正常生长,在p H 为6.0条件下抑菌活性最好,对铜离子不耐受,但对镁离子表现出了良好的耐受性,且不同浓度镁离子处理组间抑菌活性无显著差异(P >0.05)㊂体外发酵试验中,地衣芽孢杆菌19148在3%种子液接种量㊁150r /m i n 发酵28h 时,体外发酵的抑菌活性最好㊂耐药性评价试验结果显示,地衣芽孢杆菌19148对青霉素㊁四环素㊁头孢他啶㊁呋喃唑酮和多黏菌素B5种抗菌药中介,对头孢哌酮和红霉素等其他22种抗菌药敏感㊂ʌ结论ɔ地衣芽孢杆菌19148具有较好的稳定性,能应用于工业发酵饲料生产,对抗菌药不具有耐药性㊂关键词:地衣芽孢杆菌;发酵条件;抑菌活性;耐药性;益生菌制剂中图分类号:S 852.61+5文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.040 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-01-17基金项目:博士后创新人才支持计划(B X 20200365);中国农业大学横向项目 高效I G F -1和生物酵母技术开发 (201905410411435)联系方式:张钰,E -m a i l :z y 155********@163.c o m ㊂通信作者赵金标,E -m a i l :ji n b i a o z h a o @c a u .e d u .c n ;鲁琳,E -m a i l :l u l i n @b u a .e d u .c n O pt i m i z a t i o no f F e r m e n t a t i o nC o n d i t i o n s a n dD e t e r m i n a t i o no f A n t i b a c t e r i a l A c t i v i t y of B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Z H A NG Y u 1,MA X i2,Z H A OJ i n b i a o 2,L U L i n1(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,B e i j i n g U n i v e r s i t y o f A gr i c u l t u r e ,B e i j i n g 102206,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B e i j i n g 100193,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i ga t e t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t c u l t u r e a n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so nt h ea n t ib ac t e r i a l a b i l i t y o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148a n dt h e r e s i s t a n c e o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148.ʌM e t h o d ɔB a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148w a s c u l t u r e d u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n so f t e m p e r a t u r e ,p H ,m e t a l i o n s ,s h a k i n g s pe e d ,f e r m e n t a t i o nt i m ea n d i n o c u l a t i o na m o u n t i nas i ng l e f a c t o r e x p e r i m e n t a l d e s i g n ,r e s p e c t i v e l y ,th e nc e n t ri f u g ea n df i l t e r t h e c u l t u r e dl i q u i di n t os t e r i l ef i l t r a t et os t u d y i n h i b i t i o na b i l i t y a ga i n s t E s c h e r i c h i ac o l i K 88,S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u ma n d S t a p h yl o c o c c u s a u r e u s 1882u s i n g o x f o r dc u p b a c t e r i o s t a t i c t e s t .T h e d r u g r e s i s t a n c eo f B a c i l l u sl i c h e n i fo r m i s 19148t o27a n t i b i o t i c s w a ss t u d i e d b y d r u g s e n s i t i v e p a p e rm e t h o d .ʌR e s u l t ɔB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148c o u l d g r o wn o r m a l l y a t 25,37a n d 45ħ,a n dw a s i n h i b i t e da t 4a n d75ħ,a n dh a d t h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y at 37ħ.B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148c o u l d g r o w n o r m a l l y i nt h e p H r a n g e df r o m 5.0t o9.0a n dh a dt h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a t p H 6.0.B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148w a s i n t o l e r a n t t oc o p p e r i o n s ,b u t7期张钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定c o u ld t o le r a t em a g n e s i u mi o n s,a n dt h e r ew a sn os i g n if i c a n td i f f e r e n c ea m o ng t r e a t m e n t g r o u p s w i t hd i f f e r e n t m a g n e s i u mi o nc o n c e n t r a t i o n s.I n i nv i t r o f e r m e n t a t i o n,B a c i l l u s l i ch e ni f o r m i s 19148s h o w e d t h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y u n d e r t h ec o n d i t i o n so f3%s e e d l i q u i d i n o c u l a t i o n, a n d150r/m i n f e r m e t a t i o n f o r28h.I n t h e d r u g r e s i s t a n c e e v a l u a t i o n t e s t,B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148s h o w e d m o d e r a t e s e n s i t i v i t y t o p e n i c i l l i n,t e t r a c y c l i n e s,c e f t a z i d i n e,f u r a z o l i d o n e a n d p o l y m y x i nB,a n ds h o w e dh i g hs e n s i t i v i t y t ot h eo t h e r22a n t i b i o t i c ss u c ha sc e f o p e r a z o n ea n d e r y t h r o m y c i n.ʌC o n c l u s i o nɔB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s19148h a d g r e a t s t a b i l i t y a n d c o u l db e u s e d i n t h e p r o d u c t i o no f i n d u s t r i a l f e r m e n t e d f e e dw i t h o u t a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e.K e y w o r d s:B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s;f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s;a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y;d r u g r e s i s t a n c e; p r o b i o t i c s抗生素能通过其分子结构识别靶细菌膜表面的结合位点[1],抑制细菌生长甚至灭杀细菌㊂畜牧业中使用抗生素虽能提高畜禽的生长性能,但同时也带来许多危害[2-3]㊂目前,全球畜牧业禁抗已成为趋势,欧盟畜牧业在20世纪末陆续禁用维吉尼亚霉素㊁螺旋霉素等多种抗生素[4]㊂但各国畜牧业禁抗后陆续出现畜禽生产性能下降,疾病发生率上升等问题[5-6]㊂中国农业农村部第194号公告规定自2020年1月1日起,退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,自2020年7月1日起,饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料㊂寻找合适的替抗产品对中国畜牧业今后的发展极为重要㊂地衣芽孢杆菌作为替代抗生素的饲用益生菌,能分泌纤维素酶㊁几丁质酶等多种外源酶[7],可帮助畜禽消化饲料[8],改善肠道组织结构[9-10]㊂地衣芽孢杆菌具有广泛的抑菌谱,能抑制致病菌黏附在肠黏膜表面,并通过分泌多种脂肽类抑菌物质来抑制致病菌的生长[11-13],且对部分真菌及霉菌具有良好的抑制作用[14]㊂此外,有研究显示,亲缘个体间的肠道菌群存在相似性[15],地衣芽孢杆菌改变畜禽亲代肠道菌群可能对子代肠道微生物区系造成影响㊂目前,地衣芽孢杆菌已被欧美多国批准用于畜牧业生产[16-17]㊂地衣芽孢杆菌在畜牧业中应用还需探究发酵过程中的各项参数,且不同地衣芽孢杆菌菌株可能携带有不同抗生素抗性基因[18],需探究其生物安全问题㊂本研究基于前期筛选得到的1株地衣芽孢杆菌19148,测定其在体外发酵的抑菌活性及适宜的发酵条件,分析其对多种抗菌药的耐药性,以期为下一步利用地衣芽孢杆菌生产畜禽发酵饲料,探究其发挥益生功能的机理机制提供研究依据㊂1材料与方法1.1供试菌株地衣芽孢杆菌19148(B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148)由中国农业大学农业农村部饲料工业中心分离和保存[19];供试致病菌大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i K88)㊁鼠伤寒沙门氏菌(S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u m)和金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s1882)均由中国农业大学农业农村部饲料工业中心动物营养国家重点实验室保存㊂1.2培养基L B培养基㊁MH A培养基(北京奥博星生物技术有限公司);药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)㊂1.3地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析1.3.1 不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置p H2.0~12.0共11个处理,每个处理3个重复㊂用1m m o l/L的N a O H和0.5m m o l/L的H C l调整L B液体培养基p H㊂制备好的培养基用高压灭菌锅灭菌,冷却后用无菌接种环挑取地衣芽孢杆菌19148单菌落接种到100m L液体培养基中,37ħ㊁200r/m i n培养24h㊂将培养得到的菌液7500r/m i n离心15m i n,取上清液,用0.2μm滤膜过滤制成无菌滤液㊂另用无菌生理盐水分别将大肠杆菌K88㊁鼠伤寒沙门氏菌㊁金黄色葡萄球菌1882菌液稀释至D600n m值为0.05,按照1ʒ50的比例与L B固体培养基混合后,取20m L倒入培养皿,牛津杯打孔后向孔中加入200μL无菌滤液,37ħ恒温培养箱中培养24h,观察并记录抑菌圈直径㊂1.3.2不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置4㊁25㊁37㊁45和75ħ共5个处理,每个处理3个重复㊂将接种后的培养基置于相对应的温度条件下,200r/m i n培养24h㊂取菌液制3182中国畜牧兽医49卷备成无菌滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.3.3不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置0㊁1㊁2㊁4m m o l/L的铜离子组和镁离子组共8个处理,每个处理3个重复㊂用硫酸铜和硫酸镁调整L B液体培养基中铜离子和镁离子的浓度,无菌接种环挑取单菌落进行接种, 37ħ㊁200r/m i n培养24h㊂取菌液制备成无菌滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.4地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究用接种环挑取L B固体培养基表面的地衣芽孢杆菌19148单菌落,接种到盛有50m LL B液体培养基的三角瓶中(100m L规格),放入摇床37ħ㊁200r/m i n培养24h后作为种子液,后续试验用种子液进行液体接种,并以无菌发酵液的抑菌圈直径为指标,探究地衣芽孢杆菌19148的最适发酵条件㊂1.4.1不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置1%㊁3%㊁5%和7%接种量共4个处理,每个处理3个重复㊂向灭菌后的L B 液体培养基中按照种子液体积百分比进行接种, 37ħ㊁200r/m i n发酵24h,发酵液经离心过滤后制成无菌发酵滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.4.2不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置16㊁20㊁24㊁28和32h共5个处理,每个处理3个重复㊂将种子液按照1%体积百分比接至L B液体培养基,37ħ㊁200r/m i n发酵,并在相应的时间点取样,制备成无菌发酵滤液,以牛津杯试验检测其抑菌活性㊂1.4.3不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置100㊁150㊁200㊁250和300r/m i n共5个处理,每个处理3个重复㊂L B液体培养基中接种1%种子液,37ħ发酵24h后以牛津杯试验检测无菌发酵滤液的抑菌活性㊂1.5地衣芽孢杆菌19148耐药性评价以麦氏比浊管作为参考标准,用无菌生理盐水将地衣芽孢杆菌19148菌液稀释至0.5麦氏浊度单位(M C F),菌液浓度约为1.5ˑ108C F U/m L,并用L B培养基作为比对,排除培养基本身颜色对的菌液浊度的干扰㊂用无菌棉拭子蘸取少量稀释后的菌液涂布于MH A培养基表面,待干燥后将含有不同抗菌药的滤纸片贴附在MH A培养基表面,37ħ培养24h,测量并记录抑菌圈直径㊂无抑菌圈或抑菌圈直径<10m m为耐药,抑菌圈直径在10~15m m之间为中介,抑菌圈直径>15m m为敏感㊂1.6数据统计分析采用E x c e l2010和S P S S23.0软件对试验数据进行统计分析,对不同处理组间的差异进行单因素方差分析,应用D u n c a n s法进行差异显著性检验㊂P<0.05表示差异显著,0.05<P<0.10表示具有差异趋势㊂2结果2.1地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析2.1.1不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响p H为2.0㊁3.0㊁4.0㊁10.0㊁11.0㊁12.0处理组地衣芽孢杆菌19148生长受到抑制,菌液较为澄清㊂p H为5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0处理组地衣芽孢杆菌19148有明显的生长迹象,其无菌滤液对金黄色葡萄球菌1882没有抑制效果,对大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌有明显的抑制作用,其中p H5.0㊁6.0和7.0处理组的抑菌效果显著高于p H 8.0和9.0处理组(P<0.05),且3组间无显著差异(P>0.05)(图1)㊂大肠杆菌K88组间,不同大写字母表示差异显著(P< 0.05),相同大写字母表示差异不显著(P>0.05);鼠伤寒沙门氏菌组间,不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)㊂下同A m o n g E s c h e r i c h i a c o l i K88g r o u p s,d i f f e r e n t c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05),w h i l et h es a m e c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05);A m o n g S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u m g r o u p s,d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05), w h i l et h es a m el o w e r c a s el e t t e r si n d i c a t e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05).T h e s a m e a sb e l o w图1不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g.1E f f e c t o f d i f f e r e n t p Ho n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s1914841827期张 钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定2.1.2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 4和75ħ处理组地衣芽孢杆菌19148生长明显受到抑制,菌液较为澄清;25㊁37和45ħ处理组正常生长㊂37ħ处理组无菌滤液对沙门氏菌和大肠杆菌K 88有抑菌活性(P <0.05),不抑制金黄色葡萄球菌1882;4㊁25㊁45和75ħ处理组无菌滤液对3种致病菌均无抑菌活性(图2)㊂图2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g .2 E f f e c t o fd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e so nt h eb a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 191482.1.3 不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 不同浓度硫酸铜处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88㊁沙门氏菌和金黄葡萄球菌1882均没有抑制作用㊂1㊁2和4m m o l /L 镁离子处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88的抑菌活性没有显著性差异(P >0.05),且3组均显著高于0m m o l /L 镁离子处理组(P <0.05)㊂0㊁1和2m m o l /L 镁离子处理组对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性没有显著性差异(P >0.05),且3组均显著高于4m m o l /L 镁离子处理组(P <0.05)(图3)㊂图3 不同浓度镁离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g .3 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fm a g n e s i u mi o n s o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 191482.2 地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究2.2.1 不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 3%和5%接种量处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88的抑菌活性显著高于1%组和7%组(P <0.05),且3%和5%组之间无显著差异(P >0.05),1%㊁3%和5%接种量处理组无菌滤液对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性显著性高于7%组(P <0.05),且3组间没有显著性差异(图4)㊂图4 不同种子液接种量对发酵液抑菌作用的影响F i g .4 E f f e c t o f d i f f e r e n t i n o c u l u ma m o u n t o f s e e d l i q u i do n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o n l i qu i d 2.2.2 不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 28h 处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果显著高于20㊁24和32h 处理组(P >0.05)(图5)㊂图5 不同发酵时间对发酵液抑菌作用的影响F i g.5 I n f l u e n c e o f d i f f e r e n tf e r m e n t a t i o n t i m e o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o nb r o t h2.2.3 不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 150和200r /m i n 处理组无菌滤液的抑菌效果显著高于100㊁250和300r /m i n 处理组(P <0.05),且两组之间无显著性差异(P >0.05)(图6)㊂5182中 国 畜 牧 兽 医49卷图6 不同摇床转速对发酵液抑菌作用的影响F i g .6 E f f e c t o f d i f f e r e n t r o t a t i n g s pe e dof s h a k e r o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o nb r o t h 2.3 耐药性评价地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药耐药性检测结果显示,地衣芽孢杆菌19148对青霉素㊁四环素㊁头孢他啶㊁呋喃唑酮和多黏菌素B5种抗菌药表现出中介,对诺氟沙星㊁氨苄西林㊁氯霉素等其他22种抗菌药表现出敏感(表1)㊂表1 地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药的耐药性T a b l e 1 D r u g r e s i s t a n c e o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148t o 27k i n d s o f a n t i b i o t i c s m m抗菌药A n t i b i o t i c s抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e r /m m耐药性R e s i s t a n c e 喹诺酮类Q u i n o l o n e s诺氟沙星N o r f l o x a c i n 22.11敏感环丙沙星C i pr o f l o x a c i n 25.03敏感氧氟沙星O f l o x a c i n 23.74敏感青霉素类P e n i c i l l i n s青霉素P e n i c i l l i n15.56中介氨苄西林A m p i c i l l i n 16.38敏感苯唑西林O x a c i l l i n 15.72敏感酰胺醇类A m ph e n i c o l s 氯霉素C h l o r o a m p h e n i c o l 25.52敏感四环素类T e t r a c yc l i n e s 多西环素D o x y c y c l i n e 20.76敏感米诺环素M i n o c y c l i n e 20.34敏感四环素T e t r a c y c l i n e s 12.65中介大环内酯类M a c r o l ide s新霉素N e o m y c i n 25.52敏感麦迪霉素A b o r e n23.61敏感红霉素E r y t h r o m y c i n 27.71敏感氨基糖苷A m i n o g l yc o s ide s 丁胺卡那A m i k a c i n 22.43敏感庆大霉素G e n t a m i c i n 22.31敏感卡那霉素K a n a m y c i n 21.64敏感头孢菌素类C e p h a l o s po r i n s 头孢他啶C e f t a z i d i m e 11.83中介头孢曲松C e f t r i a x o n e26.65敏感头孢哌酮C e f o p e r a z o n e 18.52敏感头孢唑林C e f a z o l i n 35.53敏感头孢呋辛C e f u r o x i m e21.36敏感头孢拉定C e f r a d i n e43.41敏感糖肽类G l y c o p e pt i d e s 万古霉素V a n c o m yc i n 18.52敏感林可霉素类L i n c o m yc i n 克林霉素C l i nd a m yc i n 22.14敏感61827期张钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定续表抗菌药A n t i b i o t i c s抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e r/m m耐药性R e s i s t a n c e硝基呋喃类N i t r o f u r a n s呋喃唑酮F u r a z o l i d o n e13.81中介磺胺类S u l f o n a m i d e s复方新诺明C o m p o u n d s u l f a m e t h o x a z o l e29.05敏感多肽类P o l y p e p t i d e s多黏菌素BP o l y m y x i nB12.31中介3讨论3.1地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析饲用益生菌应用于发酵饲料的生产,首先要具备较强的抗逆性㊂饲用益生菌需要在高温加工㊁低温冷藏等饲料加工工艺过程中保持益生功能㊂王芬等[20]利用枯草芽孢杆菌发酵花生粕,发现在36ħ枯草芽孢杆菌的生物活性最高,且随温度升高或降低,其活性逐渐下降㊂苗永美等[21]通过单因素试验探究p H对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响,结果显示,当初始p H为5.0时,菌株发酵物的抑菌率最高㊂王晓洁等[22]探究镁离子浓度对侧孢短芽孢杆菌分泌抗菌脂肽的影响发现,在13.01g/L镁离子发酵液中抗菌脂肽含量最多㊂本试验中,地衣芽孢杆菌19148表现出了对外界培养条件良好的耐受性,且菌株抑菌活性的最适培养条件与前人研究一致㊂3.2地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究饲用益生菌在不同的发酵条件下会产生不同的发酵产物,为降低益生菌发酵饲料的生产成本,需对其发酵培养条件进行优化,从而提高发酵效果和益生能力㊂李光月等[23]利用响应面试验对枯草芽孢杆菌的发酵工艺进行优化,结果显示,枯草芽孢杆菌在200r/m i n的转速下,表面活性素的产量最大㊂秦楠等[24]探究了1株解淀粉枯草芽孢杆菌的发酵特性,结果表明在接种量3%㊁发酵13h时,其无菌发酵滤液的抑菌活性最好㊂但也有研究指出,枯草芽孢杆菌的最适接种量为1.46%[25]㊂导致这种差异的主要原因可能是发酵液营养水平及不同芽孢杆菌菌株生长速率的不同㊂本试验结果显示,在3%接种量㊁150r/m i n发酵28h时,地衣芽孢杆菌19148抑菌活性最好㊂3.3地衣芽孢杆菌19148耐药性评价长久以来,细菌间获取和发展一系列抗生素耐药机制一直是益生菌应用于畜禽饲料生产的重要阻碍㊂益生菌产品想要真正替代畜牧业中促生长类抗生素的使用,不仅自身不能对抗生素表现出耐药性,且不能使肠道病原菌对益生菌发挥抑菌活性的途径产生新的耐药机制㊂由于地衣芽孢杆菌属细菌的遗传相似度很高,很难用遗传标记物进行鉴定和分类,而这就需要在菌株水平对地衣芽孢杆菌的耐药性进行检测㊂本研究采用27种不同种类的抗菌药对地衣芽孢杆菌19148的耐药性进行检测,结果显示除了对多黏菌素B㊁呋喃唑酮㊁头孢他啶㊁四环素和青霉素表现为中介外,其余22种抗菌药均为敏感,因此地衣芽孢杆菌19148不具有抗菌药耐药性问题㊂4结论地衣芽孢杆菌191418对外界环境具有良好的稳定性,在p H6.0㊁温度37ħ㊁镁离子浓度为1m m o l/L的培养条件下,其抑菌活性最强㊂体外发酵过程中,3%种子液接种量㊁150r/m i n发酵28h是其抑菌活性最适发酵条件㊂药敏试验结果显示地衣芽孢杆菌对27种不同类型的抗菌药表现为中介或敏感性,不具有耐药性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B A Q U E R O F,L E V I N B R.P r o x i m a t ea n du l t i m a t ec a u s e s o ft h e b a c t e r i c id a la c t i o n o fa n t i b i o t i c s[J].N a t u r e R e v i e w sM i c r o b i o l o g y,2020,19(2):123-132.[2] H O E L Z E R K,WO N G N,T H OMA S J,e t a l.A n t i m i c r o b i a l d r u g u s e i n f o o d-p r o d u c i n g a n i m a l s a n da s s o c i a t e dh u m a nh e a l t h r i s k s:W h a t,a n dh o ws t r o n g,i s t h e e v i d e n c e[J].B M C V e t e r i n a r y R e s e a r c h,2017,13(1):211.[3] T A N G K L,C A F F R E Y N P,N B R E G A D,e ta l.R e s t r i c t i n g t h eu s eo fa n t i b i o t i c si nf o o d-p r o d u c i n ga n i m a l s a n d i t sa s s o c i a t i o n sw i t ha n t ib i o t i cr e s i s t a nc ei n f o o d-p r o d u c i n g a n i m a l s a n d h u m a n b e i n g s:As y s t e m a t i c r e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i s[J].L a n c e tP l a n e t a r y H e a l t h,2017,1(8):e316-e327.[4] C A S E W E L L M,F R I I S C,MA R C O E,e ta l.T h eE u r o p e a n b a n o n g r o w t h-p r o m o t i n g a n t i b i o t i c sa n de m e r g i n g c o n s e q u e n c e sf o r h u m a n a n d a n i m a lh e a l t h[J].J o u r n a l o f A n t i m i c r o b i a lC h e m o t h e r a p y,2003,52(2):159-161.[5] W I E R U P M.T h e S w e d i s h e x p e r i e n c e o ft h e19867182中国畜牧兽医49卷y e a r b a n o f a n t i m i c r o b i a l g r o w t h p r o m o t e r s,w i t hs p e c i a l r e f e r e n c e t o a n i m a l h e a l t h,d i s e a s e p r e v e n t i o n,p r o d u c t i v i t y,a n d u s a g e o f a n t i m i c r o b i a l s[J].M i c r o b i a l D r u g R e s i s t a n c e,2001,7(2):183-190.[6] K J E L D S E N N.T e r m i n a t e d u s e o f a n t i m i c r o b i a lg r o w t h p r o m o t e r si n p i g p r o d u c t i o n i n D e n m a r k-e f f e c t so n p i g w e l f a r e a n d p r o d u c t i v i t y[J].S U I S,2005,22:18-25.[7] MU R A S A,R OM E R O M,MA Y E R C,e t a l.B i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s o f B a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s[J].C r i t i c a l R e v i e w s i nB i o t e c h n o l o g y,2021,41(4):609-627.[8]徐小明,白建勇,宦海琳,等.地衣芽孢杆菌对发酵床饲养仔猪生长性能㊁消化酶活性及肠道主要菌群数量的影响[J].中国畜牧兽医,2015,42(4):923-928.X U X M,B A IJ Y,HU A N H L,e ta l.E f f e c to fB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s o n g r o w t h p e r f o r m a n c e,d i ge s t i v e e n z y m e sa n dt h en u m b e rof i n t e s t i n a lm a i nm i c r o b i a l f l o r a o f p i g l e t s r a i s e d i n f e r m e n t a t i o nb e d[J].C h i n a A n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2015,42(4):923-928.(i nC h i n e s e)[9] L E IK,L IY L,Y U D Y,e ta l.I n f l u e n c eo fd i e t a r yi n c l u s i o n o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s o n l a y i n gp e r f o r m a n c e,e g g q u a l i t y,a n t i o x i d a n t e n z y m ea c t i v i t i e s,a n d i n t e s t i n a lb a r r i e r f u nc t i o n o fl a y i n gh e n s[J].P o u l t r y S c i e n c e,2013,92(9):2389-2395.[10] D E N G W,D O N G X F,T O N G J M,e t a l.T h ep r o b i o t i c B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s a m e l i o r a t e s h e a ts t r e s s-i n d u c e d i m p a i r m e n t o f e g g p r o d u c t i o n,g u tm o r p h o l o g y,a n d i n t e s t i n a l m u c o s a l i m m u n i t y i nl a y i n g h e n s[J].P o u l t r y S c i e n c e,2012,91(3):575-582.[11] M A R T I R A N IL,V A R C A M O N T I M,N A C L E R I O G,e t a l.P u r if i c a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o fb ac i l l o c i n490,a n o v e l b a c t e r i o c i n p r od u ce d b y at h e r m o p h i l i cs t r a i n o f B a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s[J].M i c r o b i a l C e l lF a c t o r i e s,2002,1(1):1.[12] H ELL,C H E N W L,L I U Y.P r o d u c t i o na n d p a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o n o f b a c t e r i o c i n-l i k e p e p i tde s b yB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Z J U12[J].M i c r o b i o l o g i c a lR e s e a r c h,2006,161(4):321-326.[13] P A T T N A I K P,K A U S H I K JK,G R O V E R S,e ta l.P u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fab a c t e r i o c i n-l i k ec o m p o u n d(L i c h e n i n)p r od u ce d a n a e r o b i c a l l y b yB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s i s o l a t e d f r o m w a t e rb u f f a l o[J].J o u r n a l o f A p p l i e d M ic r o b i o l o g y,2001,91(4):636-645.[14]J I ZL,P E N GS,C H E N LL,e t a l.I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fas e r i n e p r o t e a s ef r o m B a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s W10:A p o t e n t i a l a n t i f u n g a l a g e n t[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f B i o l o g i c a lM a c r o m o l e c u l e s,2020,145:594-603.[15] G O O D R I C HJK,D A V E N P O R T E R,W A T E R S JL,e t a l.C r o s s-s p e c i e s c o m p a r i s o n s of h o s tg e n e t i ca s s o c i a t i o n s w i t ht h e m i c r ob i o m e[J].Sc i e n c e,2016,352(6285):532-535.[16] E F S A P A N E L O N B I O L O G I C A L HA Z A R D S.S c i e n t i f i co p i n i o no nt h e m a i n t e n a n c eo ft h el i s to fQ P Sb i o l o g i c a l a g e n t s i n t e n t i o n a l l y a d d e d t o f o o da n df e e d(2010u p d a t e)[J].E F S A J o u r n a l,2010,8(12):1944.[17] D E B O E R AS,P R I E S TF,D I D E R I C H S E N B.O n t h ei n d u s t r i a l u s e o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Ar e v i e w[J].A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y,1994,40(5):595-598.[18] A D I M P O N G D B,S O R E N S E N KI,T H O R S E N L,e t a l.A n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t y of B a c i l l u s s t r a i n si s o l a t e d f r o m p r i m a r y s t a r t e r s f o rA f r i c a nt r a d i t i o n a lb r e a d p r o d uc t i o n a nd c h a r a c te r i z a t i o n of t h e b a c i t r a c i no p e r o n a n d b a c i t r a c i n b i o s y n t h e s i s[J].A p p l i e d a n dE n v i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y,2012,78(22):7903-7914.[19]何恒迅.地衣芽孢杆菌19148对断奶仔猪生长性能的影响及其机制研究[D].北京:中国农业大学,2021.H E H X.S t u d y o n t h e e f f e c ta n d m e c h a n i s m o fB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s19148o n t h e g r o w t hp e r f o r m a n c e o f w e a n e d p i g l e t s[D].B e i j i n g:C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2021.(i nC h i n e s e)[20]王芬,赵腊梅.枯草芽孢杆菌固态发酵花生粕的条件优化[J].饲料研究,2022,45(2):75-78.WA N G F,Z HA O L M.O p t i m i z a t i o no fs o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f p e a n u t m e a lb y B a c i l l u ss u b t i l i s[J].F e e d R e s e a r c h,2022,45(2):75-78.(i nC h i n e s e)[21]苗永美,韩朔,苗翠萍,等.石豆兰内生细菌分离鉴定㊁发酵条件优化及对棉花枯萎病菌的抑制[J].天然产物研究与开发,2020,16(3):1-14.M I A O Y M,HA N S,M I A O C P,e ta l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o n a n d f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o no f e n d o p h y t e s f r o m B u l b o p h y l l u m s p.a n d i t si n h i b i t o r y e f f e c t o n F u s a r i u m o x y s p o r u m f.s p.v a s i n f e c t u m[J].N a t u r a l P r o d u c t R e s e a r c h a n dD e v e l o p m e n t,2020,16(3):1-14.(i nC h i n e s e)[22]王晓洁,孟凡强,周立邦,等.响应面优化侧孢短芽孢杆菌产短杆菌素发酵培养基[J].食品工业科技,2022,43(4):153-160.WA N G X J,M E N G F Q,Z H O U L B,e t a l.81827期张钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定O p t i m i z a t i o n o f b r e v i b a c i l l i n f e r m e n t a t i o n m e d i u mw i t h B r e v i b a c i l l u s l a t e r o s p o r u s b y r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y[J].S c i e n c ea n d T e c h n o l o g y o f F o o dI n d u s t r y,2022,43(4):153-160.(i nC h i n e s e)[23]李光月,李雪玲,祁姣姣,等.响应面法优化枯草芽孢杆菌表面活性素的发酵工艺[J].食品工业科技,2022,3(18):1-13.L I G Y,L I X L,Q IJ J,e t a l.O p t i m i z a t i o n o ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o f s u r f a c t i n f r o m B a c i l l u ss u b t i l i s b y r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y[J].S c i e n c ea n d T e c h n o l o g y o f F o o d I n d u s t r y,2022,3(18):1-13.(i nC h i n e s e)[24]秦楠,杨金梅,梁莹支,等.解淀粉芽孢杆菌H R H317菌株抗菌肽发酵条件优化及其抑菌活性研究[J].食品安全质量检测学报,2021,12(15):6169-6176.Q I N N,Y A N GJ M,L I A N G YZ,e t a l.O p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a n d a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o fa n t i m i c r ob i a l p e p t i d e s f r o m B ac i l l u s a m y l o l y t i c aH R H317s t r a i n[J].J o u r n a lo f F o o d S a f e t y&Q u a l i t y,2021,12(15):6169-6176.(i nC h i n e s e) [25]丰磊,魏伟群,付鸣佳,等.枯草芽孢杆菌S X3411产抑菌物质的发酵条件优化[J].江西师范大学学报(自然科学版),2021,45(5):503-513.F E N GL,W E IW Q,F U M J,e t a l.T h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s p r o d u c i n g a n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e s f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s S X3411[J].J o u r n a lo f J i a n g x i N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n),2021,45(5):503-513.(i nC h i n e s e)(责任编辑董晓云)9182。
活菌培养计数检验方法
3.2.9将平皿盖好立刻轻轻摇动均匀，平放于台上，待琼脂凝固后，翻转平皿，使底朝上，置35±2℃恒温箱内培养。
3.3观察、计数和报告
3.3.1每日观察细菌生长情况，培养至48小时计算最终结果的菌落数。
3.3.2培养到时间后，计数每个平板上的菌落数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每片中的菌落数，进行报告。
有限公司
文件编号
版号
A.0
活菌计数检验法
页次
生效日期
2020/01/02
1．目的
规范及指导生物指示剂（枯草芽孢杆菌菌片）样本中含有的活菌数量的测定。
2．适用范围
适用于菌片活菌数确认。
3．内容
3.1仪器设备
净化工作台、恒温培养箱、刻度吸管(1ml)、PBS(磷酸盐缓冲液)、琼脂培养基
3.2操作步骤
3.2.1每批菌片抽取8个菌片样品试验。
3.3.4.2若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则取最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
3.3.4.3若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
3.3.5若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.3.6若阴性对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
3.3.7菌落总数的报告以10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3.3.8菌片活菌数结果以cfu/片为单位报告。
编制：
日期：
02地衣芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
文件名称地衣芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号HC-SOP-002编制人编制日期年月日颁发部门审核人审核日期年月日印制份数批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部目的：建立地衣芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的地衣芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：QC内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、无菌蒸馏水、吐温80等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、葡萄糖5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在70个左右）的500ml锥形瓶中，再加入30ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，再补加60mL已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×101稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3 用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液1ml，加至已灭菌的平皿中，再加入50℃左右的培养基，向每个培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后，倒置于38℃的恒温培养箱内培养36h—42h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数： 5.1 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个——300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
芽孢杆菌检测方法及注意事项
芽孢杆菌检测方法及注意事项枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项一、检测方法1.试剂和培养基1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，灭菌备用。
1.2 芽孢杆菌培养基：蛋白胨：10g酵母浸粉：5gNaC1盐：10g琼脂粉：15gPH值：7.0～7.2蒸馏水：1000mL分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。
2.检测步骤2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。
b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。
c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min 时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。
e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.2.2样品的稀释a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。
b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。
c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。
冷却至室温后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。
每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。
2.3 涂平板及培养从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。
使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。
制剂微生物限度检测操作规程
制剂微生物限度检测操作规程微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。
一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30 ~35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25 -28℃，控制菌培养温度为36C +1℃。
检验结果的报告以1 9、1ml或lOcm2为单位。
1．细菌、霉菌与酵母菌计数(1)平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释级。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各Iml，置直径约90mm平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀．待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2-3个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。
在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。
合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。
液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落及酵母菌菌落数。
菌数测定阴性对照试验：取供试验用的稀释剂各Iml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。
细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时为准，菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30 ~300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数30 -100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。
如有1个稀释级在30~30~0（30 ~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稿释级在30~300 (30~100)之间时，按下式计算两级比值。
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文件名称地衣芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号HC-SOP-002
编制人编制日期年月日颁发部门
审核人审核日期年月日印制份数
批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部
目的：建立地衣芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程
范围：本方法适用于的地衣芽孢杆菌活芽孢的测定
责任人：QC
内容：
1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管
2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、无菌蒸馏水、吐温80等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、葡萄糖5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：
4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在70个左右）的500ml锥形瓶中，再加入30ml
已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，再补加60mL已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×101稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3 用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液1ml，加至已灭菌的平皿中，再加入50℃左右的培养基，向每个培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后，倒置于38℃的恒温培养箱内培养36h—42h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数： 5.1 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个——300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
5.3 若有两个稀释度，其平均菌落数在30个——300个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算
根据菌落数特征判定，分别数出平板中的地衣芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除地衣芽孢杆菌外的其他菌种）。
统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B ）和杂菌数（E ）。
6.1 有效活菌总数按式（1）计算；
A=B ×C (1)
式中：
A ——有效活菌总数，cfu/g
B ——菌落活菌数；
C ——稀释倍数。
6.2杂菌率按式（2）计算：
D=
×100……………………(2) 式中：
D ——杂菌率，%
E ——杂菌数。
E E+A。