核酸类药物的分析

（二）嘌呤的鉴别
+氨制硝酸银→白色↓→红棕色（遇光） （嘌呤碱基的特殊鉴别反应）
（三）磷酸的鉴别
有机磷→无机磷+钼酸→磷钼酸+还原剂→钼蓝
（四）特征吸收光谱
UV：嘌呤环，嘧啶环 IR

（五）熔点测定
二、检查
一般检查
酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度
蛋白质检查
磺基水杨酸溶液
2.复性
一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活 性的现象；通常使用热复性。（退火） 缓 慢 冷 却
热复性
高温变性
急 速 冷 却 热复性在基因测序中被广泛应用
复性失败
（五）颜色反应 苔黑酚反应:
RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深绿色化合物 （ λmax=670nm ）
4.检查
溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率） 取本品0.5g，加水 50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波长处测定透光率，不 得低于98.0％(供注射用)。 干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过1.0 炽灼残渣 不得过0.1％(供注射用),或不得过0.2％(供口服用 重金属 取本品1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。 次黄嘌呤 ①精密称取本品0.5g，置50ml量瓶中, 加水溶解并 稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10μl，点 于3×25cm色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约 20cm处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，不得出现杂 质斑点。 ②HPLC
核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）的 通称。
一、结构和分类
核酸 核苷酸
水
磷酸
核苷
解
戊糖
碱基
核
酸
核苷酸
代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA 而言为核糖； 代表碱基 代表磷酸基
核苷酸
磷 酸
碱 基
戊糖
O
NH
碱基
N N
酯键
N
N H
HN O N H
H2O 糖苷键
O
磷酸 O P OH
基本要求
掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物 和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的 原理 熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸 药物鉴别、检查、含量测定的原理
第一节 概述
结构和分类wk.baidu.com 理化性质
什么是核酸？
1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核， 当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何 一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步澄 清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。
pH影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.0~11.0 （二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂 （三）UV：λmax=260nm 蛋白质280nm A260/A280 纯DNA＞1.8 纯RNA应达到2.0 混有杂蛋白 比值降低
（四）变性和复性
1.变性：在某些理化因素影响下，DNA双螺旋区的 氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋结 构变成单链无规律的“线团”，但不发生共价键 的断裂，这过程称之。 变性原因：高温（一般＞75℃）、强氧化剂、强 酸、碱、尿素等； 机理：双链间氢键断开，成为两条单链（ DNA双 螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失） 特征性Tm---DNA的变性温度 82~95℃
脱氧核糖 磷酸
核糖 磷酸
稀有碱基
• 嘌呤——次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、 N2、N2-二甲基鸟嘌呤。 • 嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、 二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 • 都是基本碱基的化学修饰型。
O N
1-甲基次黄嘌呤
O N
N
N
N H
H3C
N
N
N H
H2N
鸟嘌呤
次黄嘌呤
二、理化性质
（一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性）

一、鉴别
戊糖鉴别
嘌呤鉴别 磷酸鉴别 特征吸收光谱 熔点测定
（一）戊糖的鉴别
苔黑酚反应（地衣酚反应）---凡核糖均有此反应 试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂）
现象：鲜绿色
二苯胺反应 DNA 试剂：浓硫酸，二苯胺 现象：蓝色 与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖） 现象：玫瑰红色
有关物质
纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查
三、含量测定
紫外-可见分光光度法
现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用 此法测定含量
HPLC
四、实例分析
肌苷 ATP
（一）肌苷的质量分析
1.结构：C10H12N4O5 268.23
本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含 C10H12N4O5应为98.0～102.0％。
2.性状：
本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。 本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐 酸和氢氧化钠溶液中易溶。
3.鉴别




取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二 羟基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁 各0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中 加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应 取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴， 即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基 取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定， 在248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波长 处有最小吸收。 色谱图 IR
DNA 脱氧核糖核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 胸腺嘧啶（T)
RNA 核糖核苷酸 腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸 腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 尿嘧啶（U）
核苷酸
碱基
五碳糖 酸
脱水
Fe3+
二苯胺反应: DNA中脱氧核糖+浓H2SO4 →5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺→蓝色 化合物（ λmax=595nm ） 水解后磷酸：
磷酸+钼酸→磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等） →钼 蓝（ λmax=660nm ）
第二节 嘌呤类核苷酸药物分析
嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤） 戊糖 磷酸
OHCH2 O
OH
O
H2 O
OH OH
戊糖
核苷酸
酯键
5` 4` 3` 2` 1`
碱基连接（糖苷键）
（对DNA为H）
戊糖
核糖 (in RNA)
2｀－脱氧核糖 (in DNA)
核苷
DNA & RNA
碱基
嘧啶环
RNA
DNA
胞嘧啶 C
尿嘧啶 U
腺嘌呤 A
胸腺嘧啶 T
鸟嘌呤 G
嘌呤环
类别 基本单位