抗核抗体测定——免疫印迹法
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
抗核抗体的检测方法及原理
抗核抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA测定法和免疫印迹测定法。
以下是这些方法的简要介绍和原理：
1.间接免疫荧光法：此方法是检测抗核抗体的常用方法之一。
原理是将待测标本与细胞底物片（如HEp-2细胞）的相应抗原进行反应，然后加入
荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体（通常为抗IgG抗体），形成抗原-抗体-荧光二抗的复合物。
通过荧光显微镜观察，可以判断待测标本中是否存在针对细胞相关抗原的自身抗体。
2.放射免疫法：此方法常用于检测抗DNA抗体。
原理是用同位素标记DNA，与被检血清中的抗DNA抗体结合，然后通过沉淀和对比沉淀物与上
清液中的放射活性，得到DNA的结合活性。
结合率高于一定值（通常为20%）则判断为阳性。
3.ELISA测定法：即酶联免疫吸附法，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗去，最后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。
4.免疫印迹测定法：此方法是将混合的抗原作为凝胶电泳分离，然后转印到硝酸纤维素的薄膜上，再用标记抗体进行检测和分析。
以上各种方法都有其特点和适用范围，可以根据实验需求和条件选择合适的方法进行检测。
抗核抗体的检测方法
抗核抗体的检测方法
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA），就像侦探在寻找线索一样，能精准地检测出抗核抗体是否存在呢。
比如说，在检查血液的时候，它能火眼金睛般地把抗核抗体给揪出来！
2. 免疫荧光法呀，如同一个神奇的魔法镜，可以让抗核抗体现形哟！就好比如你在黑暗中寻找东西，它一下子就把光打在了目标上，厉害吧！比如医生用这个方法能清楚地看到抗核抗体的情况呢。
3. 免疫印迹法可牛了，它仿佛是个智能识别器，对抗核抗体的辨别那叫一个准！你想想看，这不就像是在一堆东西里一下子挑出你想要的那个，是不是很神奇呀！像诊断一些疾病的时候就经常用到它呢。
4. 胶体金法呀，就像是个小巧玲珑的指南针，能快速指引出抗核抗体的方向哦！比如说在一些快速检测中，它就发挥大作用啦！
5. 化学发光法，那简直就是夜空中最亮的星呀，一下子就能把抗核抗体照亮呢！举个例子，在检测的关键时刻，它能给出最闪亮的答案！
6. 间接免疫荧光法，相当于一个精准的瞄准器，能准确无误地锁定抗核抗体呢！就像射击比赛中瞄准靶心一样厉害哟！比如在复杂的情况中它也能发挥威力。
7. 斑点酶免疫技术，如同一个细心的卫士，能牢牢地守住检测抗核抗体的关卡呀！想想看，是不是很有安全感呢！比如在特定的检测情境下它可重要啦。
8. 流式细胞术，哇塞，这可是个高科技的玩意儿呀，能高效地检测抗核抗体呢！这就好比有一双特别的眼睛，能瞬间捕捉到关键信息，厉害吧！像一些精确的分析中就少不了它。
9. 放射免疫法，那可是个厉害的角色呢，对检测抗核抗体有着独特的本领哦！就好像拥有超级力量一样，能准确找到目标呢！比如在一些专业的检测领域就有它的用武之地啦。
我觉得这些抗核抗体的检测方法都各有特点和优势，在医学诊断中都起着至关重要的作用呢！。
免疫印迹法检测抗核抗体谱比对分析
免疫印迹法检测抗核抗体谱比对分析蒋跃根;应葳;王峰来;蔡秀玲;李安生【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2014(035)001【摘要】目的比较抗核抗体谱-12S检测(antinuclear antibody profile,ANA-12S)试剂盒和抗核抗体谱线性免疫分析法检测(antinuclear antibody spectrum linear immunoassay,IMTEC-ANA-LIA)试剂盒对血清抗核抗体谱(antinuclear antibody spectrum, ANAs)检测结果的一致性,从而验证ANA-12S检测ANAs的有效性.方法收集于该院就诊的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IIF)检测抗核抗体(ANA)阳性患者标本144例,其中男21例,女123例;ANA阴性患者标本10例,其中男2例,女8例.用IMTEC-ANA-LIA和ANA-12S分别进行ANAs检测.比较和分析两种方法所得的检测结果.结果 ANA 阳性标本中两者检测阳性率均为100％,其中ANA-12S法检测阳性项目占28.8％(497/1 728),IMTEC-ANA-LIA法检测阳性项目占27.7％(479/1 728),差异无统计学意义(x2=0.46,P＞0.05),ANA-12S法与IMTEC-ANA-LIA法检测结果总符合率为97.1％,Kappa值为0.929;ANA阴性标本中两者检测的阴性率均为70％(7/10),其中3例系统性红斑狼疮(SLE)疑似患者抗SmD1阳性,阴性项目占97.5％(117/120),总符合率100％,Kappa值为1.结论 ANA-12S与IMTEC-ANA-LIA的检测结果具有较高符合率和准确性;ANA-12S试剂盒可以作为快速、简便、经济的检测方法应用于自身抗体的检测.【总页数】3页(P39-41)【作者】蒋跃根;应葳;王峰来;蔡秀玲;李安生【作者单位】中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042;中国医学科学院皮肤病医院检验科,江苏南京210042【正文语种】中文【相关文献】1.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧2.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较 [J], 李琦;彭旭娇;郭慧娟;高洁;陈丽丽;刘文娟;李雪;尚晓泓;3.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果不一致的临床意义分析 [J], 莫伟平;张泳仪4.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧;5.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较 [J], 李琦;彭旭娇;郭慧娟;高洁;陈丽丽;刘文娟;李雪;尚晓泓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验一 免疫印迹
实验一、免疫印迹免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。
它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。
由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。
而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。
而Western blot却没有这些缺点。
因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。
也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。
强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、实验材料诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。
三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。
【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。
【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。
2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。
2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。
3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。
5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
6. 同4洗涤。
7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。
8.与标准显色带比较，判断结果。
【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。
临床医学检验基础知识讲解：抗核抗体检测方法
ANA的检测方法由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。
目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。
1.免疫荧光法检测血清总ANA最常用的方法是荧光免疫组化法。
多用小鼠肝切片或印片作为细胞核基质，结果比较稳定可靠，在荧光显微镜下见到的细胞核有荧光着色为阳性反应。
如将患者血清先进行不同比例的稀释，可以做大致的定量试验，在1：80稀释仍然虽阳性时，对SLE的诊断有较大的参考价值。
在油镜下观察结果，可以将ANA阳性的荧光现象分成4种主要的荧光核型，核型的确定对临床诊断有进一步的参考价值。
①周边型表示抗DNA抗体存在；②均质型表示有抗DNP抗体；③斑点（颗粒）型多为抗ENA抗体；④核仁型多为抗核小体抗体。
SLE患者常出现周边型、匀质型或混合型，斑点型多见于混合结缔组织病，而硬皮病多为核仁型；周边型对SLE有较高的特异性。
近年有人用锥虫或血鞭毛虫（例如绿蝇短膜虫试验）作基质测定抗dsDNA抗体，因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。
因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。
另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。
2.放射免疫法常用检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。
①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。
②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。
3.ELISA临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。
目前已有试剂盒供应。
4.免疫印迹（immunoblotting）先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酸标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析（方法见第十五章）。
抗核抗体检测方法
抗核抗体检测方法抗核抗体检测是一种检测人体免疫系统中是否产生抗核抗体的检测方法。
抗核抗体是人体免疫系统对自身细胞核成分产生的自身抗体，它的产生可能与某些自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、结缔组织病等。
抗核抗体检测是诊断这些疾病的重要方法之一。
目前，常见的抗核抗体检测方法主要有免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附法（ELISA），其中IFA是目前广泛应用的技术。
以下是这两种检测方法的详细介绍：免疫荧光法（IFA）：免疫荧光法是通过抗体与标记有荧光物质的抗人免疫球蛋白结合，实现对抗体的检测。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备标本。
可以使用血清、脑脊液、淋巴细胞等标本，其中血清是最为常用的标本类型。
血清标本采血后离心分离血清即可。
步骤二：制备抗原。
可以用抗人免疫球蛋白（免疫球蛋白基因可以人工合成并表达），或者天然来源的细胞核抗原作为实验抗原。
抗原可以通过固相免疫部署在载玻片上，称为荧光抗核。
步骤三：加荧光抗体。
将标本加入荧光抗核预处理的载玻片上，通过抗体和荧光物质的结合，发出特定波长的荧光。
观察荧光显微镜下标本是否有抗核抗体与荧光抗核结合，并发出荧光信号。
酶联免疫吸附法（ELISA）：酶联免疫吸附法是采用抗原-抗体的特异性结合反应，利用酶标记反应物在固定载体上清晰可见的特性，将免疫反应产生信号转化成可见光信号。
该方法的具体步骤如下：步骤一：制备抗原。
与免疫荧光法相同，抗原可以用抗人免疫球蛋白或天然来源的细胞核抗原，固相免疫后称之为ELISA 片。
步骤二：制备酶标记抗体。
将具有高特异性的单克隆或多克隆抗体标记酶，如HRP、AP等，完成酶标记抗体的制备。
步骤三：获取样本。
样本的获取方法与免疫荧光法相同。
步骤四：洗涤。
将标本加入固定好的载体上，在空鼓内进行反应，然后通过流速控制洗涤液将未结合抗体和载体间的干扰物和废弃物全面清除。
步骤五：加入酶标记抗体。
将上述洗涤过的载体加入酶标记抗体，形成“反应物-酶标记抗体-待测样本抗体”复合物。
抗核抗体谱免疫印迹法
类风湿关节炎中的抗核抗体
抗原
阳性率
组蛋白
15-50%
单链DNA（ssDNA）
8%
U1-nRNP
3%
RANA
90-95%
干燥综合征（SS）
外分泌腺受累的自身免疫疾病
症状: - 口腔干燥 - 唾液及眼泪减少 - 腮腺肿胀 - 胰腺外分泌腺分泌不足
口腔干燥
腮腺肿胀
ANAs与干燥综合征（SS）的相关性
原发性干燥综合征中的自身抗体
抗SS-A/Ro-52抗体 抗SS-A (60 kDa)和抗Ro-52 总是分开检测!
WHY？
பைடு நூலகம்
抗SS-A/Ro-52抗体
- 天然 SS-A = RNA + SS-A 60 kDa 蛋白质 – 无需 Ro-52。 - Ro-52 并非 SLE 或 SS 患者诊断所需抗体。 - SS-A 60和 Ro-52抗原的混合包被会降低SSA抗体的疾病特异性。 - 欧蒙产品始终分别检测 SS-A 60 和Ro-52。
传统定义：
针对细胞核成分的自身抗体的总称。
根据细胞核内靶抗原分子理化特性和分布部位分类：
➢多核苷酸：dsDNA，ssDNA ，RNA ➢组蛋白：H1 , H2A , H2B , H3 , H4 , H2A-H2B复合体 ➢核浆中的核糖核蛋白（ENA）：Sm , nRNP , SSA/Ro , SSB/La ➢核仁抗原：U3-nRNP/Fibrillaria，PM-Scl/PM-1，7-2-RNP/To，
系统性红斑狼疮（SLE）
SLE在临床上各器官受累的表现
神经系统受累 (30%) 皮肤 (蝴蝶状皮疹, 盘状狼疮; 74%)
浆膜炎 (胸膜炎, 心包炎; 77%)
间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析
—
Ａ Ｎ Ａ—Ｉ Ｉ Ｆ法 与 Ａ Ｎ Ａ ｓ—Ｌ Ｉ Ａ法 检 测 结果 ： Ａ Ｎ Ａ—Ｉ Ｉ Ｆ法与 Ａ Ｎ Ａ ｓ—Ｌ Ｉ Ａ法分 别 检测 ３ ０ ０例与 ２ ６ ３例 患者血 清抗 核抗 体 和抗核抗体谱 ， 两种方法检 出的阳性率 无 显著性差异 （ Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） 。见表 １ 。 ３ Ｏ例 同 时 进 行 Ａ Ｎ Ａ —Ｉ Ｉ Ｆ 、 Ａ Ｎ Ａ ｓ— ｕＡ检测 结果 比较 ： ３ Ｏ例 中结 果 一 致 的
摘 要 目 的 ： 探 讨 间 接 免 疫 荧 光 法
（ Ｉ Ｉ Ｆ ） 检 测 抗 核 抗体 （ Ａ Ｎ Ａ ） 与线 性 免 疫 印
３ ０ ０ ０ ｒ ／ 分离 心 １ ０分 钟 ， 分 离 血清 直接 检
测。
迹 法（ Ｌ Ｉ Ａ） 检测抗核 抗体谱 （ Ａ Ｎ Ａ ｓ ） 在自 身免疫性 疾病临床诊 断中的价值 。方法 ：
种 方法不能相互取代 ， 应联合应 用。
和抗 Ｓ Ｓ Ｂ抗体多见于干燥综合征患者 ， 抗
Ｓ Ｓ Ａ抗体敏感性较强 ， 抗Ｓ Ｓ Ｂ抗体 特异性
关键词 自身免 疫性 疾病 抗核 抗体
间接 免 疫 荧 光 法 免 疫 印迹 法
２ ２例 中， １ ０例 全 阳性 ， １ ２例全 阴性 ， 一致 率７ ３ ． ３ ％； 结果不 一致 的 ８例 中 ， Ａ Ｎ Ａ—
检率 ６ ． ７ ％， 见表 ２ 。
讨 论
体 和胞 质 抗 原抗 体 。Ａ Ｎ Ａ和 Ｅ Ｎ Ａ抗 体
的检 测 ， 对胶原性疾病， 特别 是 Ｓ Ｌ Ｅ、 与
原 因分析为 ， 该谱只含有与常见 自身免 疫 性 疾病相关的 １ ２项抗 核抗 体 ， 而 不代 表
间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果不一致的临床意义分析
间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果不一致的临床意义分析莫伟平;张泳仪【摘要】目的：探讨间接免疫荧光法（IIF）检测抗核抗体（ANA）与线性免疫迹法（LIA）检测抗核抗体谱（ANAs）结果不一致的临床意义分析。
方法对6121例标本同时用IIF法检测ANA，LIA法检测ANAs，比较其二者的不符合率。
结果IIF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例，不一致率为22.5%。
IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例，不一致率为10.3%，在1107份IIF-ANA-/LIA-ANAs+标本中，阳性率最高的前5种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗SmD1、抗SSB 抗体、抗histones，阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%。
结论在自身免疫性疾病（AID）临床诊断中，应联合进行IIF筛查ANA和LIA检测特异性ANAs，避免单一方法检测导致AID患者的漏诊。
【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2016(014)019【总页数】2页(P39-39,40)【关键词】间接免疫荧光法;抗核抗体;线性免疫迹法;抗核抗体谱;自身免疫性疾病【作者】莫伟平;张泳仪【作者单位】广东东莞市人民医院检验科，广东东莞523000;广东东莞市人民医院检验科，广东东莞523000【正文语种】中文【中图分类】R446.6ANA和ANAs的检测目前已广泛用于自身免疫性疾病（AID）的诊断与疗效观察。
IIF用于总的ANA筛查试验，它不仅可以检测出血清中是否存在ANA，还可获知自身抗体所呈现的荧光模型。
但要进一步明确自身抗体的靶抗原就必须做ANAs检测，LIA可能是目前对ANAs检测最可靠的实验室研究方法［1］。
但在实际工作中，我们发现IIF检测ANA与LIA检测ANAs结果不一致。
笔者对2014年6121例临床就诊患者血清标本同时采用IIF检测ANA，用LIA检测17种特异性自身抗体，比较2种检测方法结果不一致的情况，并探讨ANA与ANAs检测结果之间的相关性及临床意义。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理免疫印迹法（immunoblotting）是一种用于检测特定蛋白质的方法，它利用抗体与目标蛋白质结合的原理，通过电泳将蛋白质分离并转移到膜上，再用特异性抗体进行检测。
本文将详细介绍免疫印迹法的原理及其在科研实验中的应用。
免疫印迹法的原理主要包括以下几个步骤，蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测。
首先，将待检测的蛋白质样品进行电泳分离，通常采用SDS-PAGE凝胶电泳。
电泳结束后，将蛋白质转移到膜上，这一步骤称为转膜。
转膜完成后，将膜进行特定抗体的孵育，使得抗体与目标蛋白结合。
最后，通过化学发光或染色等方法进行检测，从而得到目标蛋白的信息。
免疫印迹法在科研实验中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测特定蛋白质的表达水平，通过对不同条件下样品的免疫印迹检测，可以了解蛋白质在生理或病理状态下的变化。
其次，免疫印迹法也可用于鉴定蛋白质，通过与特异性抗体的结合，可以确定目标蛋白质的存在与否。
此外，免疫印迹法还可用于研究蛋白质的相互作用，比如通过共沉淀实验，可以确定蛋白质与其他分子的结合情况。
在进行免疫印迹实验时，需要注意一些关键的技术细节。
首先，样品的制备非常重要，需要避免蛋白质降解和损伤，保证实验结果的准确性。
其次，抗体的选择也至关重要，需要使用特异性较好的抗体，以确保实验结果的可靠性。
此外，在实验操作过程中，需要严格控制各个步骤的条件，比如电泳条件、转膜条件和抗体孵育条件等，以确保实验的稳定性和可重复性。
总的来说，免疫印迹法作为一种重要的蛋白质检测方法，在生物医学研究领域有着广泛的应用。
通过对目标蛋白质的特异性检测，可以为科研人员提供重要的实验数据，帮助他们更好地理解蛋白质的功能及其在疾病发生发展中的作用。
因此，掌握免疫印迹法的原理和技术要点，对于开展相关研究工作具有重要的意义。
抗核抗体谱免疫印迹法课件
操作简便
免疫印迹法自动化程度高， 操作简便，减少了人为误 差。
与其他免疫检测方法的比较
与酶联免疫吸附试验（ELISA）比较
免疫印迹法可以同时检测多个抗原，而ELISA只能检测单个抗原。
与胶体金试纸法比较
免疫印迹法具有更高的灵敏度和特异性，检测结果更可靠。
优缺点分析
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、可同时检测多个抗原。
原理
该方法基于抗原抗体反应的原理，将ANA与固相载体上的核抗原进行反应，再 通过显色反应或放射自显影等方法检测ANA的存在和滴度。
发展历程与现状
发展历程
自20世纪50年代发现ANA以来，抗核抗体谱免疫印迹法经历了放射免疫分析法、酶 联免疫吸附法（ELISA）等不同发展阶段，目前已经形成了较为成熟的检测技术。
实验操作应严格按照操作流程 进行，避免出现误差。
实验结束后应及时清洗实验器 具，整理实验台面，保持实验
室整洁。
03
抗核抗体谱免疫印迹法结果解读
结果判读标准
阴性质控
阴性结果，表示未检测 到抗核抗体谱。
弱阳性
弱阳性结果，表示抗核 抗体谱水平较低，可能
存在轻度异常。
阳性
阳性结果，表示抗核抗 体谱水平较高，可能存
缺点
成本较高、需要专业设备和技术 人员。
05
抗核抗体谱免疫印迹法的未来发展与
展望
新技术与新方法的应用
人工智能与机器学习
利用人工智能技术对免疫印迹图像进行自动识别和分析，提高检 测的准确性和效率。
纳米技术与生物传感器
应用纳米技术提高免疫印迹法的灵敏度和特异性，同时开发新型生 物传感器用于快速检测。
在免疫系统疾病。
强阳性
抗核抗体检测方法
抗核抗体检测方法
抗核抗体检测是一种通过检测人体血清中的抗核抗体（ANA）来评估自身免疫系统功能的方法。
以下是一些常见的抗核抗体检测方法：
1. 免疫荧光法：这是最常用的抗核抗体检测方法。
它使用细胞核素或其成分来作为探针，与患者血清中的抗核抗体结合，并通过荧光显微镜或免疫荧光仪观察标记物的荧光来判定阳性或阴性结果。
2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：这是一种常见的抗体检测方法，通过将抗核抗体与酶标记的抗体结合，再与细胞核素或其成分结合，最后加入酶底物以产生荧光或颜色反应，来判定阳性或阴性结果。
3. 免疫印迹分析（Immunoblot）：这种方法使用电泳将细胞核素或其成分分离开来，然后将其转移到膜上。
然后，将患者血清中的抗核抗体与膜上的目标蛋白结合，并使用酶标记的二抗或放射性同位素进行检测，来判定阳性或阴性结果。
4. 细胞结合抗体测定法：这种方法使用人类细胞进行抗核抗体检测。
血清中的抗核抗体与细胞表面上的细胞核素结合，然后通过荧光显微镜或流式细胞术来观察细胞结合情况，来判定阳性或阴性结果。
这些方法通常会综合使用，以获得更精确的抗核抗体检测结果。
ana检测方法
ana检测方法ANA检测方法。
ANA（抗核抗体）是一种自身免疫性疾病的重要指标，其检测方法对于诊断和治疗自身免疫性疾病具有重要意义。
目前，常用的ANA检测方法包括间接免疫荧光法（IFA）、酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫印迹法（immunoblotting）。
下面将分别介绍这几种方法的原理和应用。
首先，间接免疫荧光法（IFA）是目前临床上常用的一种ANA检测方法。
它通过将患者血清标本与细胞基质相结合，然后加入荧光标记的抗人球蛋白抗体，观察是否有荧光信号产生来判断抗核抗体的存在。
这种方法的优点是灵敏度高，能够检测出低滴度的抗核抗体，但缺点是操作复杂，需要专业技术人员进行操作。
其次，酶联免疫吸附法（ELISA）也是一种常用的ANA检测方法。
它利用固相酶标记技术，将抗核抗体与抗原结合后，通过酶标记的二抗结合，再加入底物产生显色反应来检测抗核抗体的存在。
这种方法操作简便，适合于大规模筛查，但灵敏度相对较低，不能检测出低滴度的抗核抗体。
最后，免疫印迹法（immunoblotting）是一种高度特异性的ANA检测方法。
它利用电泳将抗原分离，然后转移到膜上，再加入患者血清标本，通过特异性的抗人球蛋白抗体结合，最终通过显色反应来检测抗核抗体的存在。
这种方法的优点是特异性高，但缺点是操作复杂，需要较长的实验时间。
总的来说，不同的ANA检测方法各有优缺点，医生在选择适合的检测方法时需要根据临床情况和实验室条件进行综合考虑。
未来，随着技术的不断进步，相信会有更加快速、准确的ANA检测方法出现，为自身免疫性疾病的诊断和治疗提供更好的帮助。
ANA检测方法的研究和应用将继续为医学领域带来新的突破和进步。
immunoblotting免疫印迹法 -回复
immunoblotting免疫印迹法-回复什么是免疫印迹法（immunoblotting）？免疫印迹法（immunoblotting）是一种分析蛋白质的方法，用于检测目标蛋白质在样本中的存在、确定其分子量以及评估其表达水平。
该技术基于免疫学原理，利用抗体对特定的蛋白质进行特异性检测。
免疫印迹法的步骤如下：步骤一：样品制备在进行免疫印迹分析之前，需要从细胞或组织样本中提取蛋白质。
样品制备可以通过细胞裂解和组织破碎等方法来完成。
裂解细胞的方法包括机械裂解、声波裂解和化学裂解等，这会释放细胞内的蛋白质。
组织样本通常需要经过液氮的冷冻-解冻循环，配合高速离心和组织破碎试剂进行组织破碎，以获得蛋白质。
步骤二：蛋白质分离提取的蛋白质需要通过电泳方法进行分离。
常用的电泳方法有SDS-PAGE 和Native PAGE。
其中，SDS-PAGE在分离蛋白质时使用SDS（十二烷基硫酸钠）使其带负电荷，从而实现蛋白质按照分子量大小进行分离。
NativePAGE则不使用SDS，保留了蛋白质的原有电荷和构象，适用于研究蛋白质间的相互作用和酶活性等性质。
步骤三：蛋白质转移分离的蛋白质需要被转移到膜上用于后续的免疫检测。
这一步骤称为电转印（electroblotting），通常使用半干式或湿式转印两种装置进行转印。
在转印过程中，将凝胶和膜以规定的条件接触并传送蛋白质，使之迁移到膜上。
通过这一步骤，蛋白质被定位到膜上并准备进行免疫检测。
步骤四：蛋白质检测转移膜上的蛋白质现在可以进行特异性的免疫检测。
在这一步骤中，转移膜需要被封闭以避免非特异性抗体的结合，并与目标蛋白质特异性结合的一抗孵育。
一抗的选择应基于研究者所需表达的目标蛋白质。
一旦一抗与特定蛋白质形成特异性结合，未结合的一抗需要被洗去。
接下来，可以使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等二抗来进一步检测目标蛋白质。
这些二抗与一抗发生特异性结合，形成二抗-一抗复合物，可被检测出来。
抗核抗体谱检测（免疫印迹法）
抗核抗体谱检测（免疫印迹法）1 目的熟悉自身免疫性疾病抗核抗体谱检测标准操作规程，以便于更加规范化的操作，提高免疫检验质量，保证结果的准确性。
2 适用范围适用于免疫室内自身免疫性疾病抗核抗体谱检测3 职责检验科主任负责组织人员制定自身免疫性疾病抗核抗体谱检测标准操作程序，免疫室组长负责组织人员具体实施。
4 该SOP变动程序本标准程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，，并报经下述人员批准签字：专业组长、科主任。
5原理该欧蒙印迹法试剂盒用于体外定性检测血清或血浆中的人抗nRNP、Sm、SS-A（天然SS-A 和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMA M2等14种不同抗原IgG类抗体。
实验膜条上平行包被了这些高度纯化的抗原。
在第一次温育时，已稀释的血清与实验膜条反应。
如果标本阳性，特异性的IgG（也包括IgA和IgM）与相应抗原结合。
为检测已结合的抗体，加入酶标抗人IgG（酶结合物）进行第二次温育，然后加入酶底物，以产生可观察的颜色反应。
6标本采集及实验标本要求采取静脉血2-3ml，待分离血清后，离心（1500-3000转/分）15分钟，待测。
随机静脉血2ml，分离血清备用。
也可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝血浆。
稳定性：标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
7标本存放：待检患者标本于2-8 C可稳定14天，稀释后的标本应在同一个工作日内检测。
8标本运输：2-8℃密闭运输。
9标本拒收条件：蛋白变性标本，标本中含有颗粒物质，细菌污染，严重溶血或脂血标本不能做测定。
10试剂附:nRNP/Sm：小牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然U1-nRNP。
Sm：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然Sm。
SS-A：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然SS-A。
Ro-52：重组的Ro-52（52kDa），相应的人cDNA用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。
抗核抗体测定——免疫印迹法
抗核抗体测定——免疫印迹法【申请单】请完成申请单所要求项目XXX 市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】表抗核抗体测定方法方法 RIA 法免疫印迹法间接免疫荧光法本次检查选择√【材料准备】1.试验膜条：包被dsDNA、Sm、SS-A和SS-B抗原的硝酸纤维膜，为商品化试剂。
2.稀释缓冲液：直接使用3.洗涤缓冲液：20倍浓缩，用前稀释。
4.结合物液：抗人IgG结合物，直接使用。
5.底物液：3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺（1.2mmol/L），过氧化氢（2.4mmol/L）.6.终止液：硫酸溶液（0.1mol/L），直接使用。
7.标本：待检血清、阴性和阳性对照血清。
8.仪器和材料：染色缸、吸管、滴管、孵育盘、培养箱等。
【操作方法】1.样本准备：取10ul血清加入至1ml稀释缓冲液中混匀备用。
2.将试验膜条放入孵育盘，有色标面朝上，用洗涤缓冲液润湿反应膜，室温反应1分钟，去除洗涤缓冲液。
3.加入稀释后的样本，室温孵育30分钟，清除液体，加入洗涤缓冲液孵育，同时轻微振荡，5分钟后去除液体，反复洗涤三次。
4.加入结合物液，室温孵育30分钟，按前述方法洗涤3次。
5.加入底物液，室温孵育10分钟，去除底物液。
6.加入蒸馏水，室温孵育1分钟，去除蒸馏水加入终止液，室温孵育5分钟，去除终止液后彻底干燥膜条，观察结果。
【观察结果】将试验膜条黏在评价表上，与判读卡比较判断结果。
阴性：条带不显色或显示比质控条带更浅。
灰区：条带显示与质控条带无明显差异。
阳性：条带显示比质控条带更深。
【注意事项】1.试剂需复温后使用。
2.所有孵育步骤时均需使用摇床。
3.实验过程中勿使膜条干燥（最后一步除外），实验中请勿用手直接接触膜条，而应使用镊子夹取。
4.结果观察时应对齐后观察。
【报告单】XXX 市人民医院检验报告单质评合格，省内参考采集时间：接收时间：报告时间：姓名患者编号标本号临床诊断性别床号住院号送检医师年龄科别标本种类备注项目名称检测结果参考值抗ds-DNA抗体抗Sm抗体抗SS-A抗体抗SS-B抗体检验者审核者此结果仅对此标本负责。
免疫印迹法检测抗核抗体及其结果分析
免疫印迹法检测抗核抗体及其结果分析
王淑春;王志敏
【期刊名称】《实用医技杂志》
【年(卷),期】2001(008)009
【摘要】目的:为探讨免疫印迹法(IBT)对多种自身免疫性疾病的诊断价值,我们对2000例来我院风湿科就诊患者进行观察,发现系统性红斑狼疮(SLE)患者的特异性抗体-抗Sm,抗r-RNP,阳性率为50%,抗U1RNP在混合性结缔组织病(MCTD)中检出率达95%以上,但是非特异性抗体,抗SSA、抗SSB同时出现阳性有助于干燥综合征(SS)的诊断,在类风湿性关节炎患者中抗RA-54的阳性率仅为10%,但有较高的特异性.抗SCL-TO是硬皮病(PSS)的标记抗体,阳性率为37.5%,抗TO-1仅在DM/PM中检测到,是DM/PM的特异性抗体,但阳性率较低为25%,开展IBT法检测ENA抗体谱,有助于提高对各种风湿性疾病的诊断水平.
【总页数】1页(P746)
【作者】王淑春;王志敏
【作者单位】阳泉市第一人民医院,045000;阳泉市第一人民医院,045000
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧
2.间接免疫荧光法和免疫印迹法检测113例系统性红斑狼疮患者抗核抗体谱结果
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3.免疫印迹法检测161例自身免疫性疾病抗核抗体的结果分析 [J], 柳明波;熊彪;黄素兰
4.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果不一致的临床意义分析 [J], 莫伟平;张泳仪
5.间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果分析 [J], 田巧;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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抗核抗体测定——免疫印迹法
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送检日期年月日
【方法选择】
表抗核抗体测定方法
方法 RIA 法免疫印迹法间接免疫荧光法本次检查选择√
【材料准备】
1.试验膜条：包被dsDNA、Sm、SS-A和SS-B抗原的硝酸纤维膜，为商品化试剂。
2.稀释缓冲液：直接使用
3.洗涤缓冲液：20倍浓缩，用前稀释。
4.结合物液：抗人IgG结合物，直接使用。
5.底物液：3,3‘，5,5’-四甲基联苯胺（1.2mmol/L），过氧化氢（2.4mmol/L）.
6.终止液：硫酸溶液（0.1mol/L），直接使用。
7.标本：待检血清、阴性和阳性对照血清。
8.仪器和材料：染色缸、吸管、滴管、孵育盘、培养箱等。
【操作方法】
1.样本准备：取10ul血清加入至1ml稀释缓冲液中混匀备用。
2.将试验膜条放入孵育盘，有色标面朝上，用洗涤缓冲液润湿反应膜，室温反应1分钟，
去除洗涤缓冲液。
3.加入稀释后的样本，室温孵育30分钟，清除液体，加入洗涤缓冲液孵育，同时轻微振荡，5分钟后去除液体，反复洗涤三次。
4.加入结合物液，室温孵育30分钟，按前述方法洗涤3次。
5.加入底物液，室温孵育10分钟，去除底物液。