大肠杆菌表达系统PPT教学课件(1)
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基因工程3大肠杆菌表达系统课件
定性。 具有核糖体结合位点； 具有强启动子；
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%）
TAAGGAGG（N）8
TAA TGA TAG
此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。
基因工程3大肠杆菌表达系统
14
（3）翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核 糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。
（3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒；
（4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟， 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表
达质粒所携带的转化基因；
（5）选择培养基培养，选择转化体。
基因工程3大肠杆菌表达系统
19
2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜 （DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定 性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时， 其稳定性则大大提高。
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG（91%） GTG（8%） TTG（1%）
TAAGGAGG（N）8
TAA TGA TAG
此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。
基因工程3大肠杆菌表达系统
14
（3）翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核 糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。
（3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒；
（4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟， 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表
达质粒所携带的转化基因；
（5）选择培养基培养，选择转化体。
基因工程3大肠杆菌表达系统
19
2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜 （DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定 性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时， 其稳定性则大大提高。
1-大肠杆菌表达体系介绍PPT课件
转录水平 翻译水平
质粒拷贝数
.
17
启动子
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
.
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
酸性国内国外均 有，中性国内尚 未产业化
稳步增长
稳步增长，当前是纺织 酶中市场最大
宽温宽pH 碱性条件 近中性
国外有，国内目 前江南大学产业 化初步阶段
稳步增长 >3000吨
诺维信等少数国 际公司产业化， 国内产业化初步 阶段
市场空间较大 > 5000吨
目前尚无商业化， 未来皂洗、染料废水脱
成本高
色市场空间大
易操作性
• 转化，筛选、遗传稳定
可延展性
• 蛋白种类，放大
低成本性
• 发酵原料，发酵工艺和后处理
高效表达
• 副产物少，表达量高
.
11
常用工业酶表达系统的表达水平
种类 细菌 酵母
丝状真菌
菌名
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌
毕赤酵母 黑曲霉 米曲霉
里氏木霉 金孢子菌C1
表达水平
目的蛋白
总蛋白
<7g/l
20g/l
Aspergillus niger/oryzae
.
9
表达系统
工业生产：菌株、发酵工艺和后提取方法等
The good production strain is not everything, but everything is nothing without a good production strain.
大肠杆菌ppt课件
要基因型：
与基因重组相关的基因型
recA、recB、recC等
与甲基化相关的基因型
dam、dcm、mcrA、mcrB和C、mrr、hsdM等
与点突变相关的基因型
mutS、mutT、dut、ung、uvrB等
与核酸内切酶相关的基因型 hsdR、hsdS、endA等
与终止密码子相关的基因型 与抗药性相关的基因型 与能量代谢相关的基因型
四、致病性：
致病性大肠杆菌
肠道致病性大肠 杆菌
肠道外致病性大 肠杆菌
4
含粘附素和肠毒素等、 可分泌具有细胞毒性 的（类）志贺毒素
主要引起非炎症性腹 泻、出血性肠炎、溶 血性尿毒综合征等
主要引致败血症以及 尿道、生殖道、乳腺 等感染
五、微生物诊断：
从可疑症状着手分析，再采集病变组织或者收集粪便或肠内容物，划线接种于麦康 凯或伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑菌落同时接种于TSI琼脂和普通琼脂斜面，然 后革兰氏染色、镜检形态，淘汰不符合者，最后做生化试验；也可用多重PCR法检 测细菌的特异性基因。
3
概述
3
大肠杆菌在麦康凯培养基上长成红色菌落
三、生化特性：
微生物资源数据库共享平台 菌株保藏编号 NKCCMR NK 7.C 7037
普通营养琼脂 上 生 长 24h 后 ， 形成圆形凸起、 光滑、湿润、 半透明、灰白 色、中等大小 菌落。
大肠杆菌与沙门氏菌生化试验鉴别表
实验类别 葡萄糖
乳糖
麦芽糖
E.coli基因组中还包含有许多插入序列，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基 因重组而形成的。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基 因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征 叫做大肠杆菌的表现型 (Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基 因型(Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。
与基因重组相关的基因型
recA、recB、recC等
与甲基化相关的基因型
dam、dcm、mcrA、mcrB和C、mrr、hsdM等
与点突变相关的基因型
mutS、mutT、dut、ung、uvrB等
与核酸内切酶相关的基因型 hsdR、hsdS、endA等
与终止密码子相关的基因型 与抗药性相关的基因型 与能量代谢相关的基因型
四、致病性：
致病性大肠杆菌
肠道致病性大肠 杆菌
肠道外致病性大 肠杆菌
4
含粘附素和肠毒素等、 可分泌具有细胞毒性 的（类）志贺毒素
主要引起非炎症性腹 泻、出血性肠炎、溶 血性尿毒综合征等
主要引致败血症以及 尿道、生殖道、乳腺 等感染
五、微生物诊断：
从可疑症状着手分析，再采集病变组织或者收集粪便或肠内容物，划线接种于麦康 凯或伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑菌落同时接种于TSI琼脂和普通琼脂斜面，然 后革兰氏染色、镜检形态，淘汰不符合者，最后做生化试验；也可用多重PCR法检 测细菌的特异性基因。
3
概述
3
大肠杆菌在麦康凯培养基上长成红色菌落
三、生化特性：
微生物资源数据库共享平台 菌株保藏编号 NKCCMR NK 7.C 7037
普通营养琼脂 上 生 长 24h 后 ， 形成圆形凸起、 光滑、湿润、 半透明、灰白 色、中等大小 菌落。
大肠杆菌与沙门氏菌生化试验鉴别表
实验类别 葡萄糖
乳糖
麦芽糖
E.coli基因组中还包含有许多插入序列，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基 因重组而形成的。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基 因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征 叫做大肠杆菌的表现型 (Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基 因型(Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。
大肠杆菌表达系统课件
THANKS
感谢观看
3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
《大肠杆菌》课件
THANKS
感谢观看
。
食物中毒通常发生在食用被污染 的肉类、奶制品、蔬菜等食品后 ，因此食品生产和加工过程中的
卫生控制至关重要。
抗生素抗性与超级细菌
抗生素是治疗细菌感染的重要药物，但长期使用抗生素会导致细菌产生抗药性。
大肠杆菌等细菌在长期接触抗生素的过程中，会逐渐适应并抵抗抗生素的作用，形 成超级细菌。
超级细菌对多种抗生素具有抗药性，给治疗带来了极大的困难，也对全球公共卫生 安全构成了严重威胁。
致病性或提高其生物合成能力，为工业生产和医疗应入探究大肠杆菌的致病机制，为开发更有效的抗 菌药物和治疗方法提供理论支持。
加强跨学科合作
加强生物学、化学、物理学等领域的跨学科合作，利用新 技术和新方法，推动大肠杆菌研究的创新发展。
提高应用价值
将大肠杆菌的研究成果应用于实际生产和医疗实践中，提 高其应用价值和社会效益。同时，需要关注伦理和安全问 题，确保研究工作的合规性和可持续性。
致病性大肠杆菌的传播途径多样，包 括动物-人传播、人-人传播和食物-人 传播。
这些致病性大肠杆菌通过食物、水或 接触污染表面进入人体，导致腹泻、 呕吐、腹痛等症状，严重时甚至会导 致休克和死亡。
食物中毒与感染
食物中毒是指食用了被致病性大 肠杆菌污染的食物而引起的急性
中毒性疾病。
感染后可能出现恶心、呕吐、腹 痛、腹泻、发热等症状，严重时 可导致脱水、电解质紊乱和休克
05
大肠杆菌的研究进展
新技术与新方法
基因组学技术
利用新一代测序技术，对大肠杆 菌基因组进行全面解析，发现新 的基因和基因变异，为研究其生 物学特性和致病机制提供基础。
蛋白质组学技术
通过蛋白质组学方法，研究大肠杆 菌的蛋白质表达和功能，揭示其在 不同环境下的适应机制和调控机制 。
大肠杆菌表达系统详细表格课件
整合载体
整合载体的特点
整合载体可将外源基因整合到宿 主细胞的染色体上，实现稳定遗
传。
应用范围
整合载体适用于基因治疗、基因 组编辑等领域，可提高外源基因
在宿主细胞内的稳定性。
注意事项
整合载体的构建需谨慎选择整合 位点，以避免对宿主细胞基因组
造成不良影响。
噬菌体载体
噬菌体载体的特点
噬菌体载体利用噬菌体感染宿主细胞，将外源基 因表达于噬菌体表面。
宿主菌的基因改造与优化
01
02
03
04
基因敲除
去除不必要或有害的基因，提 高表达效率和稳定性。
基因定点突变
通过改变基因序列以改良宿主 菌的某些特性，如提高蛋白表
达量。
基因融会与串联
将多个基因串联或融会，以实 现多蛋白表达或增加蛋白表达
量。
质粒优化
改进质粒复制、拷贝数和稳定 性，提高重组蛋白的表达水平
感谢观看
。
2023
PART 04
大肠杆菌表达系统的载体 选择与构建
REPORTING
质粒载体
质粒载体的特点
注意事项
质粒载体是大肠杆菌表达系统中常用 的载体类型，具有自我复制能力强、 拷贝数高等特点。
质粒载体的构建需考虑选择合适的复 制子、挑选标记以及多克隆位点等要 素。
应用范围
质粒载体适用于克隆中到大型基因以 及基因簇，并能在宿主细胞内进行高 拷贝复制。
REPORTING
定义与特点
定义
大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆 菌作为宿主细胞，通过基因工程技术 将外源基因在宿主细胞内进行表达的 生物反应体系。
特点
大肠杆菌表达系统具有生长速度快、 培养成本低、易于工业化生产等优点 ，广泛应用于基因工程药物、酶制剂 、生物材料等的研发和生产。
第五章 外源基因在大肠杆菌中的表达 PPT课件
细胞质中表达的优点：
1. 形成包涵体：
a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离；
b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用；
c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受 伤害。
2. 蛋白质的产量高。
二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧 失，会导致外源片断编码的蛋白质在大 肠杆菌中超量表达。
3. 表达的质粒载体构建比较简单。
是负责λ DNA分子转录的启动子之一。PL启 动子是可以被E. coli RNA聚合酶所识别的强 启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可 以被λcI基因产物所抑制。携带PL启动子的载 体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低 的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导 致克隆基因的转录。
核糖体结合位点
启动子 转录终止子
复制 起点
1.启动子：
最佳启动子具备的条件：
第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物 的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上； 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水 平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长 的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种 极为重要的条件； 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式 使用廉价的诱导物而得以诱导。
无启动子的CAT质粒载体
Ecoli DNA
CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发 乙酰辅酶A
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定
薄层层析 放射自显影
三、常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
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RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
基底水平转录
lacZ lacY lacA
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。
启动子 P lac P trp P tac
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA
-10 区序列 V5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I
Lac 表达系统
正调节因子 CAP
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG
解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录
lac、tac 表达系统存在的问题
lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控
把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或
但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷 贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。
需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。
lac、tac 表达系统存在的问题
IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。
整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。
用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
葡萄糖代谢 cAMP浓度降低
cAMP
cAMP CAP
CAP lacI
RNA 聚合酶
Plac
基底水平转录
启动子
Trp 表达系统
以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统
转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。
在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。
大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子
转录 翻译
质粒拷贝数
启动子
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
lacO
lacZ lacY lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
启动子
Lac 表达系统
以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要。
当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一
种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。
大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。