第二章 细胞生物学研究方法

第二章细胞生物学研究方法

(the research method in the cell biology)

教学目的

1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用；

2、认识工具和方法与学科发展的相关性。

教学内容

本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法:

1．显微成像技术

2．细胞化学技术

3．细胞分选技术

4．细胞工程技术

5．分离技术

6．分子生物学方法

计划学时及安排

本章计划3学时。

教学重点和难点

生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。

1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。

2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。

3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内

容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。

4．分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离, 应掌握各种分离技术的原理和用途。

本章对分子生物学方法作了简要介绍, 为今后的学习奠定基础。简言之，本章教学重点是仪器方法的基本原理和基本应用；教学难点是电镜制样及分子杂交技术。

教学方法 讲授、参观 教学过程 2.1显微成像技术

2.1.1、光学和电子显微镜成像原理

共同点：照明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统 不同点：

• 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 • 电子显微镜：以电子束为光源。

表3-1电镜与光镜的比较

电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

2.2.2、常用的光学显微镜

⑴ 普通光学显微镜 ◆构成： • ①照明系统

利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化

利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

要求真空

不要求真空

要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa

玻璃透镜

玻璃透镜

电磁透镜

可见光（400-700） 紫外光 （约200nm)

电子束

（0.01-0.9）

200nm 100nm

LM FM EM

成像原

真空 透镜 光源

分辨本领

显微镜

• ②光学放大系统

• ③机械装置

◆原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。

◆分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。

• R=0.61λ/n sin(α/2)或者R=0.61λ/N．A．

其中λ为入射光线波长；N．A．为物镜的数值孔径（numerical aperture)，sinα/2，

n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

• 思考：如何提高显微镜的分辨能力？

◆显微镜的几个光学特点：

•制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。

•sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

•普通光线的波长为400-700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。

⑵荧光显微镜(Fluorescence microscope)

•特点：光源为紫外线，波长较短；

分辨力高于普通显微镜；

有两个特殊的滤光片；

照明方式通常为落射式。

•用于观察能激发出荧光的结构。

用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

⑶激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM)

•用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。

•能显示细胞样品的立体结构。

•分辨力是普通光学显微镜的3倍。

•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

⑷相差显微镜

• 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

①环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。

②相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍

射光的相位推迟1/4λ。

•用途：观察未经染色的玻片标本

⑸倒置显微镜（inverse microscope）

•物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。

2.2.3、光学显微镜的样品制备

⑴样品的固定

⑵包埋和切片

⑶染色

⑷放射自显影

2.2.4、电子显微镜

⑴透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）

◆原理：

• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。

• 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

• 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。

• 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。

◆制样技术

①超薄切片

•电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。

•通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

②负染技术

•用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。

③冰冻蚀刻（freeze-etching）

• 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。

⑵扫描电子显微镜

•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。