荧光分光光度法与检测技术
荧光分光光度法的名词解释
荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。
它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。
一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。
当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。
而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。
这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。
2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。
荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。
荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。
二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。
利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。
这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。
2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。
荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。
样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。
这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。
三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。
它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。
此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。
2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。
例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。
此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理荧光分光光度计是一种用来测量物质荧光特性的仪器，它通过激发样品产生荧光，然后测量样品发出的荧光强度来分析样品的成分和结构。
荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至关重要。
首先，荧光分光光度计的原理基于样品受到激发光照射后发出的荧光现象。
当样品受到特定波长的激发光照射后，其内部原子或分子处于激发态，随后会发生非辐射跃迁，从而发出荧光。
荧光分光光度计利用荧光强度来定量分析样品中的成分，因此对激发光源和荧光检测器的选择十分重要。
其次，荧光分光光度计的原理还涉及荧光发射光谱的测量。
荧光分光光度计通过选择合适的激发波长和检测波长来测量样品发出的荧光光谱，从而获得样品的荧光特性信息。
这种原理的应用使得荧光分光光度计成为一种重要的分析仪器，在生物医学、环境监测、材料科学等领域有着广泛的应用。
另外，荧光分光光度计的原理还包括荧光强度的标定和校准。
在进行荧光分光光度计测量之前，需要进行荧光强度的标定和校准，以确保测量结果的准确性和可靠性。
荧光分光光度计的原理要求对仪器进行精确的校准，同时还需要考虑到样品的荧光特性和测量条件的影响。
最后，荧光分光光度计的原理还涉及到荧光强度与样品浓度或成分之间的关系。
通过建立荧光强度与样品浓度或成分之间的标准曲线，可以实现对样品中目标成分的定量分析。
这种原理的应用使得荧光分光光度计成为一种灵敏、快速、准确的分析方法。
总之，荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至关重要。
通过对荧光分光光度计原理的深入了解，可以更好地应用该技术进行样品分析和研究，为科研和实验工作提供有力的支持。
食品纸包装材料中荧光增白剂的检测方法
162·FOOD INDUSTRY工艺 技术 刘万文 天津市武清区产品质量监督检验所食品纸包装材料中荧光增白剂的检测方法度计，在物质的最大激发波长和发射波长下测定其荧光强度，因为荧光增白剂的各类型物质激发波长与发射波长非常接近，所以该方法同紫外分光光度法，只能测定荧光物质的总量。
另外该方法受到试剂影响非常大，如溶剂极性、水的硬度、水的ｐＨ值等。
液相色谱法。
液相色谱法具有分离上的极大优势，可以用于检测荧光增白剂的各类单体，是分析荧光增白剂的较好方法。
液相色谱法包括反相液相色谱法和反相离子对液相色谱法。
（１）反相液相色谱法。
这是一种以表面非极性载体为固定相，并且以强于固定相极性的溶剂作为一种液相色谱分离模式。
我们在进行荧光增白剂的检测过程中，因为磺酸跟的基团极性弱，从而使化合物与Ｃｌｓ反相色谱柱的键和效果得到较弱，从而使分离多组分的荧光增白剂有一定的困难，所以其只能对相关检测进行少数的分析。
（２）反相离子对液相色谱法。
这是一种将离子对试剂加入到含水流动相中，从而使被分析组的分离子在流动相中与离子对试剂的反离子等中性离子对，从而增加了检测溶质与非极性固定相间的疏水性缔合作用，从而起到改善分离的效果，从而为改善多组分荧光增白剂分离提供一定的基础。
液质联用法。
色谱和质谱的联用将色谱的分离能力和质谱的定性能力有机的结合起来，可以简化样品的前处理，并且丰富分析化合物的种类，从而使得样品的分析更加简便可靠。
通过液相色谱祸合三重四极杆质谱和液相色谱祸合飞行时间质谱两种联用方法可以对部分基质的荧光增白物质进行检测。
但是还存在着一些问题，例如离子对试剂的应用容易污染仪器、电离规律不易把握、母离子寻找困难、进样后交叉污染等，因此还需要进一步的研究。
其他方法。
（１）紫外灯照射法。
针对我国食品包装用的原纸卫生标准规定，我们从试样中随机抽取纸样，放置于紫外灯下进行检查，并且要求任何一张纸样中最大的荧光面积不得大于５ｃｍ２。
水质 叶绿素a 的测定 荧光分光光度法
标题：水质中叶绿素a的测定——荧光分光光度法一、概述水是生命之源，保持水质清洁对人类健康和生态环境至关重要。
叶绿素a是植物和浮游生物体内的主要叶绿素成分，它对于水体中的生物和化学过程具有重要影响。
对水体中叶绿素a的测定具有重要意义。
在众多叶绿素测定方法中，荧光分光光度法以其快速、灵敏、准确的特点而受到广泛关注。
二、荧光分光光度法原理及优势1. 荧光分光光度法原理荧光分光光度法是通过叶绿素a在特定激发光波长下产生荧光信号，并测定荧光光谱的强度来间接测定叶绿素a的浓度的一种方法。
其原理是叶绿素a在特定波长范围内吸收光线后发生激发态转变为基态过程中发射荧光。
通过检测叶绿素a的荧光强度，可以推断水体中叶绿素a的浓度。
2. 荧光分光光度法优势a. 灵敏度高：荧光分光光度法对叶绿素a含量的检测具有高灵敏度，能够在较低浓度范围内进行准确测定。
b. 非破坏性：该方法无需对样品进行破坏性处理，不影响样品原有特性，适用于连续监测和长期调查。
c. 快速准确：荧光分光光度法测定简单快速，结果准确可靠。
三、荧光分光光度法测定叶绿素a的步骤1. 样品采集样品来源于自然水体或实验室模拟水体。
应在样品收集后尽快进行实验分析，或进行样品的冷冻保存。
2. 仪器调试根据仪器操作手册调试荧光分光光度仪，确定最佳激发波长和检测波长。
3. 样品处理将样品进行预处理，如滤过滤膜去除颗粒物，或使用溶解剂提取叶绿素a。
4. 校准仪器利用标准叶绿素a溶液校准荧光分光光度仪，确定荧光强度和叶绿素a浓度的线性关系。
5. 测定样品放置校准后的仪器测定样品荧光强度，根据标准曲线计算叶绿素a 的浓度。
四、荧光分光光度法在水质监测中的应用荧光分光光度法在水质监测中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 监测水体富营养化程度：叶绿素a是水体富营养化的重要指标之一，荧光分光光度法可以快速准确地测定水体中叶绿素a的含量，从而评估水体富营养化程度。
2. 生态环境评估：荧光分光光度法可对水体中微生物的活性和生态环境进行评估，对水体生物多样性和生态平衡的研究具有重要意义。
荧光光谱检测技术
荧光光谱技术是一种重要的光电检测技术，拥有很多独到优势，选题合理。
请赶快确立课题达成方式，完美有关技术路线，展开课题调研论证工作。
80荧光光谱检测技术荧光光谱技术是一种重要的光电检测技术，特别是在物质种类检测中有侧重要的应用。
它是对辐射能激发出的辐射强度进行定量剖析的发射光谱剖析方法。
物体经过叫短波长的光照耀后辐射出较长波长的光，这类光就是荧光，最常有的日光灯的发光原理就是物质汲取较短波长的光（紫外光）能量辐射出较长波长的光（可将光）的现象。
一、荧光光谱检测技术原理往常条件下，分子处于单重态的基态。
分子遇到紫外至红外激励的光子入射作用后，分子获取受激而惹起电子能级的跃迁或振动和转动能级的跃迁，分子受激后，处于电子激发的单重态的某种振动激发态 ( v ≠0)的分子 (见图 1)或经过内部变换 (Internal Conversion)和振动弛豫 (Vibrational Relaxation) 的非辐射，接踵发射荧光光子，回到电子基态获取荧光光谱hv f；或经过激发单重态S1和激发三重态 T1间的系间窜越 (Intersystem Crossing)和振动弛豫至 T1 ( v =0)，放出能量回到基态 S0( v =0,1)获取荧光光谱的光子 hv r。
图 1 光致发光系统部分每一种物质的分子或原子构造是唯一无二的，原子能级图也就有不一样的分布，原子能级跃迁也就会辐射出不一样频次的电磁波，就好似是人的指纹；每一种物质的荧光效应都有其特定的汲取光的波长和发射的荧光波。
利用这一特征，能够定性鉴识物质。
研究分子的荧光光谱可为研究分子的微观构造、分子的构象特色及变换状况供给帮助。
任何发荧光的分子都拥有两个特色光谱 :荧光激发光谱 (Excitation Spectrum)和荧光发射光谱 (Emission Spectrum)。
它们是荧光剖析法进行定性和定量剖析的基本参数和依照，也是荧光光谱稳态剖析中的两个基本特色。
分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
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待测样品设置
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空白校零
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开始测定
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重新计算
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九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
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一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
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一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
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七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
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5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
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操作软件包
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定性分析操作
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预扫描
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第三章 荧光分光光度法
螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；
荧光分光光度法与直接分光光度法测定饮用水中挥发酚
荧光分光光度法与直接分光光度法测定饮用水中挥发酚挥发酚在环境中危害很大，挥发酚可以污染食品或毒害空气，这有潜在的健康危害。
因此，准确地测定挥发酚的含量对饮用水质量的监督控制非常重要。
在保护环境和改善人类健康方面，可靠、准确和快速的检测技术对社会保护极其重要。
直接分光光度法和荧光分光光度法都可以用来测定饮用水中挥发酚的含量。
荧光分光光度法是一种常用的高灵敏性、快速及精确的检测方法，能够准确检测低浓度的挥发性有机物（VOCs）。
它采用荧光分子荧光发射的原理，并使用荧光检测仪对吸收和发射的光谱进行快速分析。
它在实验室环境得以快速的精确的检测，特别适合测定低浓度的挥发物。
而直接分光光度法也可以用来测定饮用水中挥发酚的含量，原理是把饮用水中挥发酚分解成体系组分，然后测定体系组分在指定波长下吸收或发射的光谱，从而得到有机物的组分含量。
这种技术具有快速、准确、适用性强和消耗少等优点，可作为测定饮用水中挥发酚的一种首选方法。
近年来，很多研究者利用直接分光光度法和荧光分光光度法研究和测定饮用水中挥发酚的含量。
例如，一项有关芝加哥城市饮用水中挥发酚含量研究表明，在一个整年的监测期内，荧光分光光度法与直接分光光度法都能够准确、可靠地测定饮用水中挥发酚的含量。
两种检测方法各有优劣，直接分光光度法较荧光分光光度法具有操作简便、分析快速、成本低廉的优势。
但是，它的灵敏度要低于荧光分光光度法，并且不能测定挥发性有机污染物的分子结构。
此外，它的量程比较窄，在分光光度实验过程中，通常会出现某些体系组分没有特定波长来表示的情况。
荧光分光光度法可以高灵敏度地测定高、低浓度有机污染物，并能够很好地反映挥发性有机物的分子结构。
此外，它也可以同时测定多种有机物，无需对体系做预处理，可以在短时间内完成实验。
挥发性有机物既可以通过直接分光光度法，又可以采用荧光分光光度法来测定，这两种技术各有千秋。
按照检测需要，在低浓度的检测时应选择荧光分光光度法，并结合其他技术提高检测的精确度和灵敏度；在高浓度的检测中，可以采用直接分光光度法，这种技术操作简单，检测结果准确可靠。
usp37---851分光光度法与光散射测定法
851分光光度法和光散射紫外、可见光、红外、原子吸收、荧光、透射比浊法、散射比浊法和拉曼光谱测定法。
吸收分光光度法是测量一化学物质电磁辐射与分子或原子间相互作用的方法。
其中常用于药物分析的技术包括紫外、可见光、红外和原子吸收光谱法。
可见光区域的分光光度测量法过去称作比色法，然而，仅在涉及人类对色彩的感觉时，用“比色法”这个术语才更准确。
荧光分光光度法是对化学物质在暴露于紫外线、可见光或其它电磁辐射时所发射光线进行测量的方法。
一般荧光溶液最大强度发射光的波长比激发光波长要长，通常大约20~30nm。
光散射是对由于溶液亚显微光密度不均一性导致的散射光进行测量的方法。
在测量分子量在1000 到几亿相对分子量间的多分散系统的平均分子量时很有用。
有两种这样的技术（透射比浊法和散射比浊法）应用于药物分析。
拉曼光谱法（非弹性光散射）是试样在强烈的单色光（通常是激光）照射下的光散射过程，从样品散射的光被用来分析频移。
用于这些测量方法的波长范围从紫外短波长一直延伸到红外波长。
为了方便参考，这个光谱范围大致分为以下几个部分：紫外线（190~380nm）、可见光（380~780nm）、近红外光（780~3000nm）、红外光（2.5~40μm或4000~250cm-1）。
光谱应用范围比较对于很多药品而言，在紫外线和可见光区域内的光谱测定比在近红外和红外光谱区域内测定的准确性和灵敏度更高。
当在1cm吸收池内观察溶液时，浓度约10μg/mL的样品溶液经常在紫外可见光区域产生0.2-0.8的吸光度。
而在红外和近红外区域，可能需要1-10mg/mL甚至100mg/mL的浓度才能产生足够的吸光度；在这些光谱范围内，池长度一般为0.01~3mm。
物质的紫外和可见光谱通常专属性不高，但适于做定量测定。
此外，对于许多物质来说，可用作鉴别的辅助手段。
近红外光谱法在药物分析中的应用越来越多，尤其是对大量样品的快速鉴别以及水分测定。
近红外尤其适合-OH和-NH基团的测定，如乙醇中水的测定、胺类存在下的-OH测定、烃类中的醇的测定以及叔胺存在情况下伯胺和仲胺的测定。
荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量
仪器部件
a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。
b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可 获得激发光谱和荧光光谱。
c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光 光度计采用光电倍增管作检测器。
药液维生素B2含量的测定
维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结 晶，其结构式为：
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸 性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色 荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强， 在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，
c. 所需试样量少、操作方法简便。
激发光谱
荧光光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与
照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，
荧光强度最大。
发射光谱
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：
I F 2.303I0bc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
I F Kc 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
荧光分析法的特点
a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更 高的灵敏度。
荧光分光光度计
互作用研究，DNA 密码的改变导致癌症病因研究，能断裂DNA 限制酶测定，荧光PCR(DNA 的放大)的研
究等;蛋白质和酶的作用研究，如DNA 的表达、细胞膜流动性及细胞膜内蛋白质研究、涉及抗体、蛋白 质和酶的ELISA 测定研究、酶活性测定等。尤其是各种新型蛋白和核酸荧光标记物的引入，各种荧光酶 联免疫分析技术 、偏振荧光测定技术以及为克服生物样品紫外区背景荧光和散射光的严重干扰而提出
的近红外区荧光测定技术的发展，为医学和生命科学领域提供了丰富的研究手段。
特点
ห้องสมุดไป่ตู้
（1）灵敏度高 比紫外/可见光分光光度法高2~4个数量级，为什么? 分光光度法所检测的是两个较大信号的微小差别，荧光光度法 检测的是很小背景值上的荧光强度。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱 （3）试样量少 （4）可提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小
光源：
光源应具有强度大、适用波长范围宽两大特点,常用光源有高压汞灯、氙灯、氙-汞弧灯等。此外，
紫外激光器、固体激光器、高功率连续可调染料激光器和二极管激光器等荧光光源把荧光法的应用范围 拓宽。 滤光片和单色器： 在荧光光度计中，通常采用干涉滤光片和吸收滤光片作为激发光束和荧光辐射的波长选择器。在荧 光分光光度计中至少选用一个，而常常是用两个光栅单色器，且均带有可调狭缝，以供选择合适的通带 。理想的单色器应在整个波长区内有相同的光子通过效率，不幸的是这种理想的单色器不存在。 检测器： 一般普通的荧光分光光度计均采用光电倍增管作为检测器。它是很好的电流源，在一定条件下其电 流量与入射光强度成正比。此外，还有光导摄像管、电子微分器、电荷耦合器阵列检测器。
III. 工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定,无磁场、电场干扰.根据样
荧光分光光度计课件72页PPT
2021/7/25
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荧光分光光度法
2、荧光分光光度计的基本结构
氙灯光源 波长范围：200~1000nm 工作压力：5~20 atm 启动电压：20~40KV 使用寿命：1000~2000h
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荧光分光光度法
1、荧光分光光度法简介
荧光分光光度法 当用紫外光照射某种物质时，这些物质会发出
各种颜色和不同强度的光，当紫外光停止照射时， 这种光线也随之消失。我们这种光线称为荧光。依 据物质所发荧光的颜色和强度建立起来的定性和定 量的分析方法称为荧光分光光度法。
荧光分光光度法 2、荧光分光光度计的基本结构
2.3、样品室 样品室比较宽大，以容纳各种光径的样品
池和附件。如流动池，微量池等。样品池全用 石英材料制成，没有玻璃样品池。
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荧光分光光度法
2、荧光分光光度计的基本结构
F-7000 荧光分 光光度 计样品 室
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荧光分光光度法
1、荧光分光光度法简介
光学分析仪器
因为物质对光的选择性吸收的特点，他的 吸收有 如下的特性
M + h M*
基态
激发态
M +热 M + 荧光或磷光
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荧光分光光度法
1、荧光分光光度法简介
原子发射光谱法：原子荧光分析 发射光谱法
分子发射光谱法 ： 荧光分析、磷光分析 光谱分析法
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
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荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
核酸定量检测方法
核酸定量检测方法
核酸定量检测是一种常见的生物学实验技术，用于测定DNA或RNA的浓度和纯度。
这种方法可以用于许多应用，例如基因克隆、PCR反应、RNAi实验等。
核酸定量检测的方法包括分光光度法、荧光定量法、凝胶电泳法等。
其中，分光光度法是最常用的方法。
该方法通过测量核酸在紫外光下的吸收值来确定其浓度。
荧光定量法是一种更灵敏的方法，它使用荧光染料来测量核酸的浓度。
凝胶电泳法是一种用于分离和可视化核酸的方法，通过与已知浓度的DNA或RNA进行比较，可以确定未知样品的浓度。
无论使用哪种方法，都需要注意样品的纯度。
检测前应使用比色法或荧光探针等方法检测样品中是否存在杂质，如果存在杂质，可能会影响检测结果。
此外，还应注意样品的保存和处理条件，以避免样品受到污染或损坏。
总之，核酸定量检测是生物学实验中非常重要的一步，正确的方法和技巧可以确保实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
测定血中亚硝酸盐的荧光分光光度法
一、引言在医学领域，血液化验是常见的临床检查方法之一。
通过血液化验，可以了解人体内部的生化反应和疾病状态。
而血液中的亚硝酸盐作为一种重要的生化指标，在临床诊断和治疗中具有重要的意义。
对血中亚硝酸盐的测定方法进行研究和优化具有重要意义。
二、亚硝酸盐的生物学意义亚硝酸盐是一种重要的生物化学物质，它在人体内具有多种生物学功能。
其一是与血红蛋白发生结合，形成亚硝基血红蛋白，对维持血液的正常功能具有重要意义。
其二是与氨基化合物反应生成致癌物质亚硝胺，因此在食品安全和环境保护中具有一定的监测价值。
三、传统测定方法的局限性传统测定血中亚硝酸盐的方法主要包括化学法和比色法，这些方法操作简单、成本低廉，但存在检测灵敏度低、特异性差等局限性。
寻求一种更为准确、灵敏、快速的测定方法具有重要的现实意义。
四、荧光分光光度法的优势荧光分光光度法是一种高灵敏度、高特异性的生化检测方法，通过测定样品在吸收特定波长光后自发发射出的荧光强度来定量分析样品中的物质。
在血中亚硝酸盐的测定中，荧光分光光度法具有很大的优势，可以克服传统测定方法的局限性，为临床血液化验提供更为准确的检测数据。
五、荧光分光光度法的原理和步骤荧光分光光度法测定血中亚硝酸盐的原理是利用亚硝酸盐与荧光试剂反应生成荧光产物，再利用荧光分光光度仪测定其荧光强度来定量分析亚硝酸盐的含量。
具体步骤包括：（1）制备样品：取血样进行前处理，获得样品溶液。
（2）反应：将样品溶液加入荧光试剂，反应产生荧光产物。
（3）测定：利用荧光分光光度仪测定样品溶液中荧光产物的强度。
（4）计算：根据荧光强度和标准曲线计算出亚硝酸盐的含量。
六、荧光分光光度法的应用前景荧光分光光度法作为一种高灵敏度、高特异性的生化检测方法，在血中亚硝酸盐的测定中具有广阔的应用前景。
它不仅可以用于疾病诊断和治疗过程中的监测，还可以在食品安全、环境保护等领域发挥重要作用。
随着仪器技术和荧光试剂的不断改进，荧光分光光度法在血液化验领域的应用前景将更加广阔。
荧光分光光度法 (Fluorescence Spectrophotometry)
荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。
•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。
促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。
在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。
不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。
随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。
例如：X-荧光、红外荧光等。
•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。
•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。
利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。
•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
•荧光和磷光同属光致发光。
通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。
•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
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李维斌
第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素
温度
溶剂
溶液酸碱性
荧光熄灭剂
散射光
激发光源
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分析化学（第2版）谢庆娟
李维斌
第一节 基本原理
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏
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◆能力要求 掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器的基本操作 方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的 操作技术。
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第一节 荧光分光光度法的基本原理
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第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光
波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标
，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质 所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。
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具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数 荧光效率 F 吸收激发光的量子数
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第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系
大的共轭π键结构 λex（激发） λem（激发） φF
苯
萘
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第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动
您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
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第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
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286
278
321
0.11
0.29
蒽
四苯
365
390
400
480
0.46
0.60
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第一节 基本原理
分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18
芴F=1.0
取代基的影响
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第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发单色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
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◆学习目的
通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以 及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条 件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧 光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等 专业课程奠定基础。
第一节 基本原理
溶液荧光光谱具有如 下特征：
斯托克斯位移
荧光光谱系
蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）
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第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征
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第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
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第一节 基本原理
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第一节 基本原理
光源
目前最常用的是氙灯
单色器（分光系统）
激发单色器
发射单色器
样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英
检测器
光电倍增管
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第一节 基本原理
（三）仪器校准
灵敏度校准
波长校准
激发光谱和发射光谱校准
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◆知识要求
熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激 发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的 特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条 件和方法。了解。 了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫 外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析 中的应用。
振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和
结构情况。
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第一节 基本原理
（一）仪器类型
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
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某些物质吸收紫外 - 可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。 荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
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第一节 基本原理
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
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第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
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