生产菌种的来源共69页文档
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第2章 生产菌种的来源
诱饵法
2.2
菌种的分离
2．2．1 施加选择性压力分离法
在自然界获得的标本,是很多种类微生物的
混杂物,一般采用平板划线或平板稀释法进行纯
种分离。但大多数采集的样品中，所需微生物并
不一定是优势菌或数量有限。
为了增加分离成功率，可通过富集培养增加
待分离菌的数量。
富集培养
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖
诺卡氏菌 游动放线菌属 小瓶菌属 角质菌属
处理方法 加热，55℃，6分钟
100℃，1h或40℃， 2—6h 膜过滤法 离心法 空气搅拌法
土壤、根土 水 海水、污泥 发霉的稻草
化学方法
含1%几丁质培养基 用CaCO3提高pH进 行培养
用涂石蜡的棒置于碳 源培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
2.2.2.4 抗病毒药物产生菌的分离
• 由于病毒增殖是在细胞内，药剂难以达到。利用 作用于核酸的方法筛选得到的药物毒性高。
– 如利用鸡胚线维芽细胞的噬菌斑形成法，发现了抗病 毒的壳二孢氯素（Ascochlorin）和衣霉素 （Tunicamycin）。 – 用小平板测定由病毒引起的细胞变性效果（CPE）也 是一种有用的筛选方法。 – 检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶 抑制剂，也是一种选择性更高的筛选方法。
• 一般认为能作用于细胞表面酶的物质，可能具有 免疫修饰作用。 • 因此以存在于细胞表面的氨基肽酶B，白氨酸氨 基肽酶，氨基肽酶A，碱性磷酸脂酶为靶性物质， 研究了这些酶的抑制剂，发现抑制这些酶，会增 强细胞性免疫或抗体产生能力。 • 这说明可以用细胞表面酶的抑制法，筛选免疫激 活剂产生菌（见书p21）。
细菌菌种筛选的原则
菌种来源
2.1.1.2 待筛选样品的性质
2.l.1.3 筛选方案的设计 基本上可利用以下三种不同的筛选方法 1）整体生物； 2）完整细胞； 3）亚细胞制剂。
2..1.2微生物选择性分离的原理和发展
在过去40年间曾筛选出许多产生新的有用的次级 代谢物的菌种。这些菌种多半是以经验式的筛选方法 获得的。大多数的抗生素均由放线菌纲产生。下面介 绍放线菌纲为主的分离方法原理和发展。 选择性分离方法大致可分为五个步骤： 含微生物材料的选择；材料的预处理；所需菌种的 分离；培养；菌落的选择和纯化。以上任何一个阶段 都可引入选择压力。
通常采用膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜 置于培养基的表面，放置乃个小时后移去，或一直留 在上面。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响， 如处理放线菌繁殖体含量很低的海水，有人先将样品 离心然后才过滤。
收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线 菌孢子可在空气搅动下进行。并可用－风筒或一简单 的沉淀室收集孢子。然后，用Anderson取样器将空气 撞击在培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的 细菌数目。
2.1.3.l 施加选择压力的分离方法
A 富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量 的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利 于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件。通过 把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基可以重新建 立选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养 物到固体培养基上。这里，移种的时间是关键，应在 所需菌种占优势的情况下移种。
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关） 生产特性要符合工艺要求
2.1菌种的来源 2.1.1 生物物质产生菌的筛选 2.1.l.1 微生物——生物产物的来源 微生物现在和将来都是具有各种生物活性的 新产物的丰富资源。这一章的目的是要研究如 何才能筛选到具有所需生物特性的新产物。除 了初级代谢产物，如氨基酸和维生素外，微生 物还用于生产许多次级代谢产物。筛选这类产 物的两个成功要素在于 1）产生菌的选择； 2）采用什么样的筛选方案（检测系统）。 选择筛选方法有两个要点即选择性和灵敏度。
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
生产菌种的来源
2.随机分离法
自然界标本是微生物的混杂物 （优势菌株—非优势菌株）
优势菌株——直接在平板培养基上划线 非优势菌株——富集培养，施加压力，不利于
其他菌株的成长，使目标菌株成为优势菌株。例 如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素， 或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只 有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而 其它微生物就可能死亡或淘汰。
苍玄
釜石市
太平洋
研究所
海鞘
鲍鱼
珊瑚
海藻
Bacillus subtilis subsp. Subtilis IFO13719T A4B17
Inhibition zone
1 cm
山西省，运城，硝池，嗜盐菌
山西省，运城，硝池，嗜盐菌 中国的死海
烟台的盐场
徐州市 铜山新区 奎河（环境污染物降解菌）
团聚体周围的等氧线
根际微生物
（1）几个基本概念 根际 根际效应 根土比
溶胞物质 植物黏液 渗出物 植物黏液 黏质
渗出物和 分泌物 植物黏液 植物黏液
植物根际
根际rhizosphere 由植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的
独特圈带。它以植物的根系为中心聚集了大量的细菌 、真菌等微生物和蚯蚓、线虫等土壤动物，形成了一 个特殊的生物群落。
《课程安排》
微生物工程概论 生物菌种的来源 优良菌种选育 菌种保藏的原理与方法 培养基 微生物的代谢调控和代谢工程
《微生物工程的概念》
微生物工程
菌株选拔 生产工艺 下游处理
野生菌株 工程菌株 半成品 产品
基因工程 细胞工程 酶工程
发酵工程 生物反应器工程
提纯技术
生产菌种的来源
《要点》
1 生物物质产生菌的筛选 微生物是生物活性物质的丰富资源 标本采集 标本预处理
自然界标本是微生物的混杂物 （优势菌株—非优势菌株）
优势菌株——直接在平板培养基上划线 非优势菌株——富集培养，施加压力，不利于
其他菌株的成长，使目标菌株成为优势菌株。例 如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素， 或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只 有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而 其它微生物就可能死亡或淘汰。
苍玄
釜石市
太平洋
研究所
海鞘
鲍鱼
珊瑚
海藻
Bacillus subtilis subsp. Subtilis IFO13719T A4B17
Inhibition zone
1 cm
山西省，运城，硝池，嗜盐菌
山西省，运城，硝池，嗜盐菌 中国的死海
烟台的盐场
徐州市 铜山新区 奎河（环境污染物降解菌）
团聚体周围的等氧线
根际微生物
（1）几个基本概念 根际 根际效应 根土比
溶胞物质 植物黏液 渗出物 植物黏液 黏质
渗出物和 分泌物 植物黏液 植物黏液
植物根际
根际rhizosphere 由植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的
独特圈带。它以植物的根系为中心聚集了大量的细菌 、真菌等微生物和蚯蚓、线虫等土壤动物，形成了一 个特殊的生物群落。
《课程安排》
微生物工程概论 生物菌种的来源 优良菌种选育 菌种保藏的原理与方法 培养基 微生物的代谢调控和代谢工程
《微生物工程的概念》
微生物工程
菌株选拔 生产工艺 下游处理
野生菌株 工程菌株 半成品 产品
基因工程 细胞工程 酶工程
发酵工程 生物反应器工程
提纯技术
生产菌种的来源
《要点》
1 生物物质产生菌的筛选 微生物是生物活性物质的丰富资源 标本采集 标本预处理
2-生产菌种的来源
如蛋白酶、脂肪酶、果胶酶等ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 液体培养方法：摇瓶培养（分批式富集培养） 连续培养（恒化式富集培养）。
摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养 物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性 压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物 接种到固体培养基上，以获得单菌落。
转种的时间是关键，应在所需菌种占优势的 情况下移种。
霉 菌
• 1.根霉：酿酒工业，生产淀粉酶、脂肪酶
等。黑根霉、米根霉、华根霉 2.毛霉：生产腐乳、乳酸、琥珀酸、甘油、 转化甾体化合物等，糖化能力强 3.红曲霉：制备红曲、酿红酒、制醋，生 产腐乳、蛋白酶、淀粉酶、柠檬酸 4.曲霉：生产有机酸 5.青霉：有机酸、抗生素
• •
• •
• 担子菌： • 藻类：螺旋藻，单胞藻生产石油 • 生物工程菌：胰岛素、干扰素等。
陆地和水域中 未被培养微生物比例的估计
生境 可培养微 生物的比 例% 0.001-0.1 0.25 0.1-1 生境 可培养微 生物的比 例% 1-15 0.25 0.3
海水 淡水 半自养湖
活性污泥 沉积物 土壤
未污染河口 0.1-3
如何筛选？
关键在于要根据生产实际需要、目的代 谢产物的性质、可能产生所需产物微生物菌 种的分类地位、这类微生物分布、特性以及 生态环境等，设计选择性高的分离筛选方法， 才能快速从可能的环境和混杂的多种微生物 中获得所需菌种。
2. 抗肿瘤药物产生菌的分离 抗肿瘤药物作用机理：破坏核酸或 抑制核酸生物合成。利用这一原理筛选 抗肿瘤药物的常用方法有生化诱导分析 法和SOS生色检测法。
3. 酶抑制剂产生菌的分离
原理：如果某种化合物能在体外抑制某种关键 的人体酶，它就有可能在体内有药理作用。酶 抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理 关系明确的酶作为靶酶进行筛选。
摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养 物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性 压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物 接种到固体培养基上，以获得单菌落。
转种的时间是关键，应在所需菌种占优势的 情况下移种。
霉 菌
• 1.根霉：酿酒工业，生产淀粉酶、脂肪酶
等。黑根霉、米根霉、华根霉 2.毛霉：生产腐乳、乳酸、琥珀酸、甘油、 转化甾体化合物等，糖化能力强 3.红曲霉：制备红曲、酿红酒、制醋，生 产腐乳、蛋白酶、淀粉酶、柠檬酸 4.曲霉：生产有机酸 5.青霉：有机酸、抗生素
• •
• •
• 担子菌： • 藻类：螺旋藻，单胞藻生产石油 • 生物工程菌：胰岛素、干扰素等。
陆地和水域中 未被培养微生物比例的估计
生境 可培养微 生物的比 例% 0.001-0.1 0.25 0.1-1 生境 可培养微 生物的比 例% 1-15 0.25 0.3
海水 淡水 半自养湖
活性污泥 沉积物 土壤
未污染河口 0.1-3
如何筛选？
关键在于要根据生产实际需要、目的代 谢产物的性质、可能产生所需产物微生物菌 种的分类地位、这类微生物分布、特性以及 生态环境等，设计选择性高的分离筛选方法， 才能快速从可能的环境和混杂的多种微生物 中获得所需菌种。
2. 抗肿瘤药物产生菌的分离 抗肿瘤药物作用机理：破坏核酸或 抑制核酸生物合成。利用这一原理筛选 抗肿瘤药物的常用方法有生化诱导分析 法和SOS生色检测法。
3. 酶抑制剂产生菌的分离
原理：如果某种化合物能在体外抑制某种关键 的人体酶，它就有可能在体内有药理作用。酶 抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理 关系明确的酶作为靶酶进行筛选。
第二章生产菌种的来源
富 集
高温
pH条件
培养基营养成分（使某种碳源、氮源成为唯一碳源、氮源等） 在分离培养基上加入不同类型的抗生素
16
富集（enrichment)培养
富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设 计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最 适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势 种变为人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。
多数样品目的菌非优势菌或数量有限，为了增加分离 成功率，可通过富集培养增加待分离菌的数量 利用不同种类微生物生长繁殖对环境和营养的要求不 同，如温度、pH、氧气、渗透压、碳源、氮源等。
P17 表2-3 几种选择性培养基分离放线菌 表2-4 分离不同微生物时常用的抗生素或试剂
15
氧控制
好氧微生物 厌氧微生物 嗜热微生物 非嗜热微生物 嗜酸微生物 嗜碱微生物
27
试验菌的选择是成功的关键，它直接与检 出的灵敏性、抗菌素的活性和抗菌谱有关； 专一性强的筛选技术，主要是利用与抗生 素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂、 抗体等
28
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法
抗肿瘤药物产生菌：利用DNA修复能力突变株进行 抗肿瘤药物的筛选；
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 酶抑制剂（药物）产生菌：某种化合物能在体外抑制 某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用。故 主要选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选
3
二、生产菌种的分离（separation）
新菌种的分离:从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地 把所需要的菌种挑选出来； 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重 新进行分离纯化； 优良的菌种的筛选和分离，必须要有合适的工艺条件 和合理先进的设备与之配合。
高温
pH条件
培养基营养成分（使某种碳源、氮源成为唯一碳源、氮源等） 在分离培养基上加入不同类型的抗生素
16
富集（enrichment)培养
富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设 计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最 适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势 种变为人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。
多数样品目的菌非优势菌或数量有限，为了增加分离 成功率，可通过富集培养增加待分离菌的数量 利用不同种类微生物生长繁殖对环境和营养的要求不 同，如温度、pH、氧气、渗透压、碳源、氮源等。
P17 表2-3 几种选择性培养基分离放线菌 表2-4 分离不同微生物时常用的抗生素或试剂
15
氧控制
好氧微生物 厌氧微生物 嗜热微生物 非嗜热微生物 嗜酸微生物 嗜碱微生物
27
试验菌的选择是成功的关键，它直接与检 出的灵敏性、抗菌素的活性和抗菌谱有关； 专一性强的筛选技术，主要是利用与抗生 素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂、 抗体等
28
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法
抗肿瘤药物产生菌：利用DNA修复能力突变株进行 抗肿瘤药物的筛选；
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 酶抑制剂（药物）产生菌：某种化合物能在体外抑制 某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用。故 主要选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选
3
二、生产菌种的分离（separation）
新菌种的分离:从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地 把所需要的菌种挑选出来； 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重 新进行分离纯化； 优良的菌种的筛选和分离，必须要有合适的工艺条件 和合理先进的设备与之配合。
第二章_菌种的来源
具有准确的转录后修饰功能
具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化 具有产物胞外分越功能， 具有重组基因的高效扩增和表达能力 具有贴壁生长特性， 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长 CHO很少分泌自身的内源蛋白 很少分泌自身的内源蛋白
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物的特性及工业微生物的要求
二、工业化菌种的要求
• 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 能够利用廉价的原料，简单的培养基， • 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操 有关合成产物的途径尽可能地简单， 作性要强 • 遗传性能要相对稳定 • 不易感染它种微生物或噬菌体 • 产生菌及其产物的毒性必须考虑（最好与致病菌无关） 产生菌及其产物的毒性必须考虑（最好与致病菌无关） • 生产特性要符合工艺要求
自然界中有目的微生物分离的原则
四、菌落的选出
从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（ 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35） ） 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长， 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别
菌株选育、 菌株选育、分子改造
自然选育在工业生产上的意义
问题： 问题：
高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 回复突变：高产菌株在传代的过程中， 高产性状的丢失，生产性能下降， 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低， 自然选育虽然突变率很低 ， 但却是工厂保证稳产高产的 重要措施
具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化 具有产物胞外分越功能， 具有重组基因的高效扩增和表达能力 具有贴壁生长特性， 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长 CHO很少分泌自身的内源蛋白 很少分泌自身的内源蛋白
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物的特性及工业微生物的要求
二、工业化菌种的要求
• 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 能够利用廉价的原料，简单的培养基， • 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操 有关合成产物的途径尽可能地简单， 作性要强 • 遗传性能要相对稳定 • 不易感染它种微生物或噬菌体 • 产生菌及其产物的毒性必须考虑（最好与致病菌无关） 产生菌及其产物的毒性必须考虑（最好与致病菌无关） • 生产特性要符合工艺要求
自然界中有目的微生物分离的原则
四、菌落的选出
从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（ 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35） ） 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长， 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别
菌株选育、 菌株选育、分子改造
自然选育在工业生产上的意义
问题： 问题：
高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 回复突变：高产菌株在传代的过程中， 高产性状的丢失，生产性能下降， 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低， 自然选育虽然突变率很低 ， 但却是工厂保证稳产高产的 重要措施
第2章 菌种的来源
第二章 菌种的来源
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
第二章 菌种的来源 (新)
2011-6-27
12
问题： 问题：
生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生 微生物（包括动、植物细胞） 产我们所需的一切产品， 产我们所需的一切产品，但是涉及到工业 化生产对于某一种特定的产品， 化生产对于某一种特定的产品，只有特 才具有大量表达的潜力。 定的微生物才具有大量表达的潜力。
基因的直接进化： 基因的直接进化：
点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等
2011-6-27
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四、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、 (1977 枯草牙胞杆菌沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞) 酵母(既是微生物又是真核细胞)
谷氨酸发酵的菌种：
棒杆菌属，短杆菌属、 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属 或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 其它氨基酸生产菌：
常规菌种一般也是以谷氨酸生 产菌选育而成；工程菌， 产菌选育而成；工程菌，大肠 杆菌， 杆菌，枯草芽孢杆菌
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三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 FDA的批准 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、 牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌
微生物工程菌种及来源
在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性（表2-4） 如： 分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；
分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
选择性分离原理和技术
• 生长条件的选择与控制原理 –控制营养成分 –控制培养基酸碱度 –添加抑制剂 –控制培养温度 –控制通气条件
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明 圈法初筛
• 常用于分离某些酶产生菌 • 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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五、利用固体平板的生化反应进行分离
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
• 选择性分离技术 –富集液体培养技术 –固体培养技术
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
A.富集液体培养
• 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 • 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 • 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
某些必要试验和毒性试验
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二、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等
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选择性分离原理和技术
• 生长条件的选择与控制原理 –控制营养成分 –控制培养基酸碱度 –添加抑制剂 –控制培养温度 –控制通气条件
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明 圈法初筛
• 常用于分离某些酶产生菌 • 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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五、利用固体平板的生化反应进行分离
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
• 选择性分离技术 –富集液体培养技术 –固体培养技术
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A.富集液体培养
• 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 • 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 • 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
某些必要试验和毒性试验
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二、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
生产菌种的来源-精品文档
第二章 生产菌种的来源
微生物工程的工业生产三个要素： 生产菌种的性能 发酵及提纯工艺条件 生产设备 其中优良的菌种是最重要的。
微生物是发酵工业的灵魂（张星元、木下祝郎）
“微生物细胞”是生物学的概 念；“微生物细胞机器”是工程学 的概念。菌种微生物细胞是对应的 发酵产物的细胞机器，因此是有工 业生产个性的微生物细胞。微生物 细胞机器是从天然的微生物细胞改 造成的，因此天然的微生物具有成 为微生物细胞机器的潜在能力。
如蛋白酶、脂肪酶、果胶酶等。 液体培养方法：摇瓶培养（分批式富集培养） 连续培养（恒化式富集培养）。
摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养 物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性 压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物 接种到固体培养基上，以获得单菌落。
转种的时间是关键，应在所需菌种占优势的 情况下移种。
霉 菌
• 1.根霉：酿酒工业，生产淀粉酶、脂肪酶
等。黑根霉、米根霉、华根霉 2.毛霉：生产腐乳、乳酸、琥珀酸、甘油、 转化甾体化合物等，糖化能力强 3.红曲霉：制备红曲、酿红酒、制醋，生 产腐乳、蛋白酶、淀粉酶、柠檬酸 4.曲霉：生产有机酸 5.青霉：有机酸、抗生素
• •
• •
• 担子菌： • 藻类：螺旋藻，单胞藻生产石油 • 生物工程菌：胰岛素、干扰素等。
ห้องสมุดไป่ตู้.1.3.标本的预处理
(1)采用热处理方法减少材料中的细菌数
(2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞 (3)采用化学方法 (4)诱饵法：将固体基质（如蛇皮、花粉）等加到 待检的土壤或水中，待其菌落长出后再铺平板分 离。
(5)空气搅拌法 ：在空气中搅拌，收集孢子沉淀， 如稻草的处理。
2.1.4.富集培养 在采集的样品中，如果目的微生物是优势 菌，则可以直接分离纯化，但多数情况下不是 优势菌，因此需要设法增加分离菌的数量，这 就需要进行富集培养。
微生物工程的工业生产三个要素： 生产菌种的性能 发酵及提纯工艺条件 生产设备 其中优良的菌种是最重要的。
微生物是发酵工业的灵魂（张星元、木下祝郎）
“微生物细胞”是生物学的概 念；“微生物细胞机器”是工程学 的概念。菌种微生物细胞是对应的 发酵产物的细胞机器，因此是有工 业生产个性的微生物细胞。微生物 细胞机器是从天然的微生物细胞改 造成的，因此天然的微生物具有成 为微生物细胞机器的潜在能力。
如蛋白酶、脂肪酶、果胶酶等。 液体培养方法：摇瓶培养（分批式富集培养） 连续培养（恒化式富集培养）。
摇瓶培养（分批式富集培养）：是指将富集培养 物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性 压力，如此反复转种几次后，再取此富集培养物 接种到固体培养基上，以获得单菌落。
转种的时间是关键，应在所需菌种占优势的 情况下移种。
霉 菌
• 1.根霉：酿酒工业，生产淀粉酶、脂肪酶
等。黑根霉、米根霉、华根霉 2.毛霉：生产腐乳、乳酸、琥珀酸、甘油、 转化甾体化合物等，糖化能力强 3.红曲霉：制备红曲、酿红酒、制醋，生 产腐乳、蛋白酶、淀粉酶、柠檬酸 4.曲霉：生产有机酸 5.青霉：有机酸、抗生素
• •
• •
• 担子菌： • 藻类：螺旋藻，单胞藻生产石油 • 生物工程菌：胰岛素、干扰素等。
ห้องสมุดไป่ตู้.1.3.标本的预处理
(1)采用热处理方法减少材料中的细菌数
(2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞 (3)采用化学方法 (4)诱饵法：将固体基质（如蛇皮、花粉）等加到 待检的土壤或水中，待其菌落长出后再铺平板分 离。
(5)空气搅拌法 ：在空气中搅拌，收集孢子沉淀， 如稻草的处理。
2.1.4.富集培养 在采集的样品中，如果目的微生物是优势 菌，则可以直接分离纯化，但多数情况下不是 优势菌，因此需要设法增加分离菌的数量，这 就需要进行富集培养。
菌种的来源
国内菌种保藏机构27
• • • • • • • • • • • • • • ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CIVBP 中国兽医药品监察所 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心 HKUCC 香港大学保藏中心
自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。
如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪 ），会导致放线菌群的 增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。
2019年2月28日星期四 长江大学生科院生物工程系 20
B、地理和气候条件
南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素 产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。原因是南方温 度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、 土壤有机质丰富。冬季温度低气候干燥；春季温度开始回升 但雨水较多；夏季天气炎热温度高；秋季采土样最为理想。 采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射， 蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取 5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。 北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录 地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样 品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
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概念不同
• 在微生物的新陈代谢中，一般将微生物 从外界吸收各种营养物质，通过分解代 谢和合成代谢，生成维持生命活动的物 质和能量的过程，称为初级代谢 • 而次级代谢是相对于初级代谢而提出的 一个概念。一般认为，次级代谢是指微 生物在一定的生长时期，以初级代谢产 物为前体，合成一些对微生物的生命活 动无明确功能的物质的过程
生产菌种的来源
高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；
分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 控制pH 可分离嗜酸或嗜碱微生物；
第二章
生产菌种的来源
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源
第一节
发酵工业常用的微生物
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身
的生长
有些微生物能进行复杂的代谢
有些微生物能利用较复杂的化合物
有些微生物能在极端的环境下生长
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
• 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离 地面 5-15cm 处的土约 10g ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋 中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以 备查考；及时分离。
四、标本的预处理
第一次平板分离
第二次增殖培养 第一次原种斜面 （保存）
第二次平板分离
第二次原种斜面 定量或半定量测定 初筛（1株1瓶） 第二次原种斜面 （保存）
第三次平板分离
第三次原第四次菌种保藏 （保存）
初步工艺条件摸索
再复筛
1株3-5瓶 较优菌株
总结三、食品酶制剂生产有关的微生物
食用酶都要经过一系列研究的毒理试验，目前已同意使 用的仅仅少数微生物生产的食用酶。
α-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌 水解淀粉制造饴糖、葡萄糖和糖浆等；
糊精、啤酒、黄酒、酒精、酱油、醋、果 汁、味精、面包的生产等；
蔬菜的加工等；
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等 控制pH 可分离嗜酸或嗜碱微生物；
第二章
生产菌种的来源
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源
第一节
发酵工业常用的微生物
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身
的生长
有些微生物能进行复杂的代谢
有些微生物能利用较复杂的化合物
有些微生物能在极端的环境下生长
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
• 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离 地面 5-15cm 处的土约 10g ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋 中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以 备查考；及时分离。
四、标本的预处理
第一次平板分离
第二次增殖培养 第一次原种斜面 （保存）
第二次平板分离
第二次原种斜面 定量或半定量测定 初筛（1株1瓶） 第二次原种斜面 （保存）
第三次平板分离
第三次原第四次菌种保藏 （保存）
初步工艺条件摸索
再复筛
1株3-5瓶 较优菌株
总结三、食品酶制剂生产有关的微生物
食用酶都要经过一系列研究的毒理试验，目前已同意使 用的仅仅少数微生物生产的食用酶。
α-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌 水解淀粉制造饴糖、葡萄糖和糖浆等；
糊精、啤酒、黄酒、酒精、酱油、醋、果 汁、味精、面包的生产等；
蔬菜的加工等；
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
第二章菌种的来源
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 • 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
• 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
放线菌的分离
• 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎， 无菌海绵压印土样后压印平板后培养。 • 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以 减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培 养。也可洗下微生物后振荡培养。 • 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量 种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉 积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
•
•
次代培养及纯化步骤
1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布 不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落 对琼脂平板进行分类。 2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添 加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。 3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征 如色素、菌落形态等进行最初分组。 4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离 琼脂平板上进行筛选。
2．植物体采集方法
• 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、 安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一 小块，并注意不要损伤周围边缘。 • 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在 一片叶上的取样部位。 • 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法 相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时， 一般与根际土样一起保存。
2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、信息完整：采好的样必须完整地标上样本的 种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、 生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；