高效液相色谱柱的正确使用及维护

高效液相色谱柱的正确使用及维护

杨锡祥

(安徽省淮南市药品检验所,安徽淮南　232007)

关键词:高效液相;色谱柱;维护

随着色谱分析理论和技术的发展,高效液相色谱仪在分析领域特别是药品分析领域得到了广泛使用,它是集分离与检测于一身的分析手段,其分离的核心部件是色谱柱,它既是样品组分分离的场所,又是仪器的一种耗材,价格昂贵,正确的使用,可在分析数万个以上的样品后仍能保持良好的性能,而不正确的操作,则可能在一次使用中即告报废[1]。因此,对其正确的使用及维护不仅可以保证检测的准确性,而且还可以最大限度的延长使用寿命,降低检测成本。

1　高效液相色谱柱的发展现状

尽管经过数十年的发展,出现了各种各样的专用色谱柱,如制备柱、分析柱和各种微型柱,但色谱柱主体上仍由柱体、柱内填料和两端的接头组成。由于使用了高效填料,并不需要很长的柱长,常规分析柱多为15～30cm的直型柱。由于高效液相色谱柱要承受系统高压,所以柱体一般选用金属材质。大部分色谱柱的接头为通用尺寸,可互换使用。

目前国内市场上色谱柱供应商很多,大部分为进口柱或进口填料国内装填柱,国内自产柱基本上来源于大连依利特科学仪器有限公司。国外比较知名的品牌有安捷伦公司的Zorbax系列填料柱,W ater公司的μBondapak系列填料柱,美国Supelco公司的Supelco柱,瑞典Akzo Nobel公司的Kr oma2 sil填料柱,迪马公司的D ia monsil柱以及部分日本岛津公司的产品,此外Merk公司和Mecherey2Nagel公司也是世界知名的色谱填料和色谱柱生产厂家。这些厂家的色谱柱技术成熟,性能可靠,但价格较国产柱昂贵的多。较小的厂家生产的色谱柱基本上是购买填料自行装填而成,由于装填技术的差别,性能上有一定差距。

2　影响色谱柱使用寿命的主要因素

2.1　流动相因素

2.1.1　流动相pH　不同基质的填料具有不同的pH适用范围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mg・L-1,且在pH1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量,考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相pH范围约为1～8[2]。键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用,使填料对流动相的适应范围大大增加,如现在广泛使用的反相色谱填料C

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(十八烷基硅烷键合硅胶),其pH适用范围可达2～10。当流动相pH值超出酸性范围时,键合相易发生水解而流失;当流动相pH超出碱性范围时,会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子,这两种反应均是不可逆反应,特别是在温度较高(>40℃)的环境下,会使柱效迅速降低而报废。

2.1.2　流动相变质　当前使用最为广泛的是硅基键合相填料,当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸盐缓冲液时,水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌,从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相独立存贮,因存放时间较长而容易发生此类问题。

2.1.3　流动相纯度　目前广泛使用的填料颗粒粒径范围在3～10μm,孔径在6～10n m,色谱柱在使用中会有大量的流动相通过,如流动相含有微量不溶性杂质颗粒,则很容易在柱头部位被截留,久而久之,造成色谱柱机械性堵塞,引起柱压升高而无法正常使用。

2.1.4　其它因素　如流动相的极性对柱子也有一定影响,甲醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱,正丁醇、二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱,碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱,酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱[3]。

2.2　样品因素

2.2.1　样品的溶解性　样品试样在配制中,如有少量微粒未能完全溶解,则会随试样一起进入色谱柱,同样会沉积在柱头处,造成色谱柱的堵塞。

2.2.2　样品的纯度　样品中可能含有待分析组分以外的各种组分或杂质,这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附,从而使固定相的活性点被覆盖,保留特性发生变化。

2.2.3　样品的化学性质　待测试样中的各种组分与填料之间应具有化学稳定性,比较典型的是在使用氨基键合柱时,应避免使用含羰基的化合物和流动相,如丙酮、乙酸乙酯等,以免固定相中的NH

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和酐、酮发发希夫(Schiff)缩合而使固定相破坏[3]。

2.3　其它因素　影响色谱柱寿命的因素很多,除流动相和样品因素外,还有其它一些外在因素,如柱压的影响,温度的影响,色谱柱的正确冲洗,色谱柱的正确安装等。

3　高效液相色谱柱的正确使用

3.1　加装保护柱　保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(50～100次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。

3.2　过滤流动相和样品　流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0.45μm(0.22

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・安徽医药　A nhui M edical and Phar m aceutical Journal　2006August;10(8)