生物化工工艺学--第2章--工业微生物基础(下)

诱发突变是指用各种物理和化学等因素人为的使诱变对象 细胞内的遗传物质发生变化
物理诱变剂
物理诱变剂：射线如紫外线、 X— 射线、 γ— 射线，快中 子等。 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中 小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般 都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。
富集培养的方法
1）控制营养成分 营养成分是C、N、无机盐及维生素等，各种微生物对各种营养成分 的要求是有差异的，因此，控制富集培养基中的营养成分，对浓缩 所需菌种是有益的。
2）控制培养基的酸碱度 各种微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的，细菌和放线菌一般要 求中性和偏碱性，酵母和霉菌一般要求偏酸性。故可将培养基调节 到一定的pH值有利于抑制不需要微生物的繁殖。
2 富集培养
根据所选菌种的生理特性，加入某些特定物质，使所需的微生物繁 殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物生长繁殖。
如：
筛选纤维素酶生产菌：以纤维素作为唯一碳源 筛选脂肪酶：以植物油作为唯一碳源
筛选酵母菌：控制适宜的培养基和pH值，可降低细菌的增殖率，霉菌
生长慢 筛选放线菌：在土壤样品的悬浮液中加10%的酚数滴 筛选霉菌：一般在培养基临用前添加灭过菌的乳酸或链霉素
在无菌条件下用毛细滴管加入到灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管装量 约为3~4滴。
（四）冷冻 装入悬液的安瓿管应立即冷冻，冷冻温度达-30℃即可。 （五）真空干燥
冷冻结束后应立即进行真空干燥。
（六）安瓿管的熔封
熔封是在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。
（七）标签 在安瓿管灭菌前加入有菌名、日期的小纸片。 （八）安瓿管的保藏 冷安瓿管应置于4~5℃下低温保藏，保藏期一般可达5~10年。 （九）安瓿管的启封
(四)中间培养
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，
让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来， 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异 细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的 不稳定和将来的菌株退化。
3）控制培养温度和热处理 不同种类微生物所适宜的生长温度不同，利用不同培养温度可使不 同的嗜温性微生物生长速度不同。
4）添加抑制剂 添加专一性抑制也可达到抑制不需增殖的微生物的目的。
可通过控制营养成分、培养基pH、 添加抑制剂、培养温度、通气条件 及热处理来提高筛选效率。
3 纯种分离
常用的分离方法有划线法和稀释法。 划线法——将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线，菌样经过 多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。 稀释法——不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定
方法：在小试管内盛入土壤或砂子，121℃灭菌 2~3次，细菌加入浓的悬
液，真菌和放线菌可直接刮下孢子匀和（载体湿润），将小试管放入
真空干空器或在干燥器中加入五氧化二磷，试管口可熔封或用石蜡封 口，置于5℃保藏，其保藏期一般为两年，有些可达10年。
特点：此法适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌，存
1）加蜜饯、糖果、蜂蜜环境的土壤中----耐高渗透压的酵母菌、柠檬
酸产生菌、氨基酸产生菌等
2）食品加工厂、饭店等的污水中常含有淀粉----淀粉酶产生菌 3）热带森林的腐叶烂草下的土壤----产纤维素酶的微生物 4）从油田的浸油土壤中----有利用石蜡、芳香烃、烷烃的微生物 5）从白腐态树木中----可分离出分解木质素的微生物
直至留下多次考察生产性状好的3~5株菌株。
二 微生物的育种
工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目
的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的 优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。
工业菌种育种的方法 诱变 基因转移 基因重组
1 诱变育种
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不 很高。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国 内外提高菌种产量、性能的主要手段。
第四节 工业微生物菌种的保藏
微生物菌种保藏的基本原理 根据微生物生理、生化特点，人工地创造条件，使微 生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
特点：低温、干燥、缺氧。
一 斜面保藏法和穿刺保藏法
1 斜面保藏法
方法：当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后， 一般在5℃左右可保藏3~6个月，到期后重新移种一次。 特点：适用范围广（细菌、真菌和放线菌），但传代多了容易发 生变异，同时污染机会也增加。
2 穿刺保藏法
方法：将培养基制成软琼脂，装入小试管内，灭菌后用接种针 将菌种穿刺接入培养基中，生长旺盛时覆盖2~3 mm的无菌 液体石蜡。菌种可在冰箱中保藏半年至一年。 特点：有些真菌可保藏 10年，适于形成孢子能力很差的丝状真 菌，对固氮菌、双歧杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等不适宜。
二 干燥保藏法（沙土管法）
甲基磺酸乙酯
亚硝基胍
5-氟尿嘧啶
秋水仙碱
表2.1 各种化学诱变常用的浓度、处理时间等参考资料
表2.2 菌种选育常用诱变剂
2 基因转移
基因转移是用物理的、化学的或生物学的方法将目的基 因导入受体细胞并使之表达的一种技术。 包括横向和纵向两个方向：纵向传递即通过繁殖进行的亲 代和子代的基因传递；横向传递：是指在差异生物个体之间， 或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流。 /showfile-373.html
2 保藏方法
（一）安瓿管的准备 将安瓿管洗净后干燥，灭菌后，再在60℃烘箱中干燥。
（二）分散剂的准备
其作用是尽量减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤。常用的分散剂有 后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵
抗力较弱，产孢子的微生物需适当延长培养期以得到成熟的孢子。
3 基因重组
发生在生物体内(如减数分裂 中异源双链的核酸交换)和在体外 环境中用人工手段使不同来源 DNA重新组合的过程。
2 诱变育种的步骤
出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养
分离和筛选
(一)出发菌株的选择
（1）自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。
活期短。
三 悬液保藏法
方法：在将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水、磷 酸缓冲液或生理盐水中保藏，大部分能保藏一年或更长。
特点：此法适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。
四 冷冻干燥保藏法----比较常用 1 保藏原理
在将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使 细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。
在无菌条件下，将熔封口处在火焰上稍加热，立即加上1~2滴无
菌蒸馏水，使玻璃产生裂缝，轻击即可断落。一般使用经过复壮的 第二代菌种。
五 液氮保藏法
方法：在将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，加入浓度为 10%的甘油或 5%的DMSO作为防冻的保护剂，熔封后开始降温至 -25℃。将安瓿管 保藏至-196℃的液氮中。此法一般可保藏2~3年，有时可达9年。
（2）在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。
（3）每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 （4）出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留 作继续诱变。 （5）要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由 于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 （6）根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复
量注入平板，使每一微生物都远离其它微生物而单独生长为菌落，从
而得到纯种。
4 生产性能的测定
生产性能的测定可分为初筛和复筛。
筛选时培养条件确定是关键，培养基的组成、通风量、pH值、培养
温度应根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件以及前 人经验等到进行综合考察，慎重选定。 一般来说，初筛时，一株一瓶，根据测定结果取其中10~20%进行复 筛，复筛一般一株三瓶，进一步淘汰后可作几种培养条件的尝试，
(五)分离和筛选
筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌 落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法 上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的 作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将 90%的 菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株， 最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分 离，纯化菌株。
（2）土壤中采样的注意事项 1） 由于土壤表层缺少水分，而且它以常受日光照射、风吹和行人踩踏， 不利于微生物的生长，所以采样一般采集离地表5~15cm的土壤为样品。 2） 由于土壤水分过多，则可能造成土壤缺氧而使微生物生长不良，同 时不仅能使土壤缺氧，而且由于流水，往往改变土壤中微生物的分布， 因此避免雨季采样。 3）通风情况：在通风较好的土壤中，细菌、放线菌繁殖较快，而通风 差的土壤中，酵母、霉菌较多。 4）细菌或放线菌在碱性土壤中较多，它们在偏酸性土壤中受到抑制， 而酵母菌则喜欢偏酸性的环境。
第三节 工业微生物菌种的分离和选育
获得菌种的途径：
（1）向菌种保藏机构索取有关菌株。国内：工业微生物菌种保藏管 理中心（CICC）；农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） ；中国 微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） 。国外：美国典型菌种保 藏保藏中心（ATCC）；日本大阪发酵研究所（IFO）等。 （2）从自然界中筛选。
紫外作用光谱正好与细胞内核 酸的吸收光谱一致，因此，在紫外 线光的作用下能使DNA链断裂、 DNA分子内和分子间发生交联， 从而导致菌体的遗传性状发生改变。
紫外线诱变枯草芽孢杆菌