第五章 分子荧光分析法
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荧光光谱分析法
2
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
3
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
16
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
15
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
5
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
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第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
16
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
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c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
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小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
56
5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
51
3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
chapter5分子磷光和荧光
有不同衍射图
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
分子荧光分析法
实验技术
一、样品的制备 二、测定条件的选择
A、激发波长和发射波长的选择 B、狭缝宽度的选择
三、反应条件的选择
A、溶液酸度的选择 B、显色剂的浓度 C、温度的影响
分子荧光分光光度法的应用
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好，重现性好、方法 简捷以及取样量少等优点，使其越来越成为分析化学工作者 必需掌握的一种重要分析方法。另外仪器设备不复杂也是其 一大优点。
（b）、有机化合物的分析
医药卫生、环境保护、 农副产品质检等。
有机化合物的荧光分析是荧光分析法研究中最活跃、应用最广泛、 发展最有前途、涉及生命科学课题最多的分析法。
B、定量测定中的应用
分子荧光分析法可用于物质的常量、微量 以及痕量分析。
定量测定的依据：
定量分析常用的基本方法 1、标准对照法; 2、标准曲线法；
1. 打开荧光光度计和计算机，预热，对荧光光度计进行仪器初始化。 2. 选择测量参数。依次在不同的激发波长下扫描发射光谱，通过叠 加的谱图确定物质的荧光发射峰。最后确定最大发射波长值。 3. 在确定的最大发射波长下做激发光谱，测量物质的最大激发波长值。 4．记录四种物质的发射光谱和激发光谱，对它们 的荧光谱图进行比较分析。 5. 数据记录。
----苯环类物质的荧光光谱分析及定量测定
一、方法原理 二、分子荧光分光光度计 分子荧光分理
荧光的激发光谱和发射光谱
如果固定荧光的发射波长（即测定波长），而不断改变 激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得 到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称 激发光谱）。
如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的 测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的 荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱(简称发射光 谱)。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
分子荧光分析法实验
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
10-6 ~ 10-2 s
F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光 强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若 固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发 光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的 曲线，称为激发光谱。
1.2 荧光光谱
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架 内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零 时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
7.未知试样的测定：
将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标 准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
定性分析：φf；λex；λem；峰形等
其它（略）
分子相互作用研究；
显微成像（物理迁移与化学衍化的原位 “显迹”）
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C 高端生化研究： 代谢动力学跟踪；
分子荧光分析法
分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
荧光光谱法
荧光又可分为分子荧光和原子荧光。
由于不同的物质其组成与结构不
同，所吸收光的波长和发射光的波长 也不同，利用这个特性可以进行物质
的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，
它所发射的荧光强度就不同，测量物 质的荧光强度可对其进行定量测定。
荧光分析法（fluorescence analysis）
就是利用物质的荧光特征和强度，对 物质进行定性和定量分析的方法。
（fluorescence efficiency）。荧光效率
也称荧光量子产率，用f 表示。
kF 发射的荧光量子数 Φf 吸收的光量子数 k F kVR k IC k ISC k EC k P
可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化
常数降低的因素均可增加荧光量子产
率。通常，kF 由分子结构决定（内
生荧光。而在 pH6 ～ 7 的溶液中，则形
成12的配合物，不产生荧光。
总之，溶液pH值对荧光物质的荧光
光谱、荧光效率及荧光强度均有影响。 需通过条件实验找出 pH 与荧光强度的
关系，确定最适宜的pH范围，以提高分
析的灵敏度和准确度。
荧光熄灭
由于荧光物质分子间或与其它物质相互 作用，引起荧光强度显著下降的现象叫
C=O、—F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子
π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类
取代基则对荧光的影响不明显，如—R、—
温度 温度对被测溶液的荧光强度有明 显的影响。当温度升高时，介质粘度
减小，分子运动加快，分子间碰撞几
率增加，从而使分子无辐射跃迁增加， 荧光效率降低。故降低温度有利于提
高荧光效率及荧光强度。
波长扫描）。然后以激发光波长为横坐
标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
第五章第2节_分子荧光和磷光分_[1]...
![第五章第2节_分子荧光和磷光分_[1]...](https://img.taocdn.com/s3/m/7e56e601581b6bd97f19eac1.png)
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二、荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强
既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
(2)生物与有机化合物的分析
见表
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三、磷光分析法的应用
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光 是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃 迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振 动能层，然后跃迁回到基态发生的。与荧光相 比，磷光具有如下三个特点： （1）磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低。 （2）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的，这种跃迁 是自旋许可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常 在10-7~ 10-9s，磷光是T1 S0跃迁产生的，这 种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小， 因而辐射寿命要长，大约为10-4~ 10s。
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可获得三维光谱图的仪器
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
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磷光检测
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷
光寿命的差别，采用磷光
镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 杜瓦瓶。
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2.室温磷光
由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择 的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法 （RTP）。 （1）固体基质室温磷光法（SS-RTP） 此法基于测量室温下吸附于固体基质上的有 机化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多， 有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载 体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸 钠、聚合物、纤维素膜）等。理想的载体是既 能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增 加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐 射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。
二、荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强
既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
(2)生物与有机化合物的分析
见表
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三、磷光分析法的应用
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光 是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃 迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振 动能层，然后跃迁回到基态发生的。与荧光相 比，磷光具有如下三个特点： （1）磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低。 （2）磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的，这种跃迁 是自旋许可的跃迁，因而S1态的辐射寿命通常 在10-7~ 10-9s，磷光是T1 S0跃迁产生的，这 种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小， 因而辐射寿命要长，大约为10-4~ 10s。
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可获得三维光谱图的仪器
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
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磷光检测
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷
光寿命的差别，采用磷光
镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 杜瓦瓶。
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2.室温磷光
由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择 的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法 （RTP）。 （1）固体基质室温磷光法（SS-RTP） 此法基于测量室温下吸附于固体基质上的有 机化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多， 有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载 体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸 钠、聚合物、纤维素膜）等。理想的载体是既 能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增 加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐 射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
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② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
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激发光谱与发射光谱的关系
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(2-巯基乙醇存在，pH9~10的缓冲溶液)
2.无机化合物的荧光分析 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成 荧光配合物
研究对象 ▪阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、 Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、 Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr ▪阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光 配合物的荧光减弱甚至熄灭
IF 2.3I0abc
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
第二节 荧光分析仪器
激发滤光片
发射滤光片
930型荧光计光路示意图
一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
数据处理 仪器控制
发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
3．下列对荧光的叙述正确的是：（ C ）
A．从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B．从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态 C．从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D．从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态
判断题
1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量 所致。( )
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
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1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
[课后练习]
▪名词解释：荧光与磷光、振动弛豫 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
填空题
1．荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光
2．荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷
光是由
。
3．荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是
激发波长。
4．能够发射荧光的物质应具备的条件是
、
。
5．影响荧光强度的外部因素有
。
选择题
1．荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ B ） A．完全一样 B．基本相似 C．肯定不一样 D．难以说清
2．对荧光测定最有干扰的是：（ B ） A．波长比入射光长的瑞利光 B．波长比入射光长的拉曼光 C．波长比入射光短的瑞利光 D．波长比入射光短的拉曼光
荧光分析仪器的主要部件
➢激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 ➢分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管） ➢显示系统：指针式、数字式及计算机显示
二、荧光分析仪器的类型 ➢1.荧光光度计 ➢2.荧光分光光度计
➢荧光分光光度计 激发单色器
样品池
发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
It
I0
荧光分光光度计 样品池
It IF,p
I0
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
定性依据荧光光谱和激发光谱
二、定量分析
定量依据：F=Kc
1. 标准曲线法
直接荧光标准曲线法
F Fx
Cx
Cs
2.直接比较法 Fs F0 Cs Fx F0 Cx
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长 有关。 （ ）
3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。
() 4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品
溶液进行校正。
()
➢pH值 弱酸、弱碱
NH
+ 3
OH H+
OH -
NH 2
H+
NH -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
Cx
Fx Fs
F0 F0
Cs
第四节 荧光分析新技术
一、荧光新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 ➢三维荧光分析 ➢核酸分子荧光探针 ➢薄层扫描法中的荧光扫描法
荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物
▪有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环 结构的氨基酸类及蛋白质 ▪药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环； 维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) ▪中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发射的光量子数 吸收的光量子数
IF Ia
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
两种光源(紫外+可见)
空白溶液 (T=100%)
紫外无吸收 两面透光
荧光分光光度计
入射光与荧光垂 直方向
一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%)
低荧光材料 四面透光
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池
2.无机化合物的荧光分析 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成 荧光配合物
研究对象 ▪阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、 Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、 Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr ▪阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光 配合物的荧光减弱甚至熄灭
IF 2.3I0abc
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
第二节 荧光分析仪器
激发滤光片
发射滤光片
930型荧光计光路示意图
一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
数据处理 仪器控制
发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
3．下列对荧光的叙述正确的是：（ C ）
A．从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B．从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态 C．从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D．从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态
判断题
1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量 所致。( )
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
[课后练习]
▪名词解释：荧光与磷光、振动弛豫 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
填空题
1．荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光
2．荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷
光是由
。
3．荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是
激发波长。
4．能够发射荧光的物质应具备的条件是
、
。
5．影响荧光强度的外部因素有
。
选择题
1．荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ B ） A．完全一样 B．基本相似 C．肯定不一样 D．难以说清
2．对荧光测定最有干扰的是：（ B ） A．波长比入射光长的瑞利光 B．波长比入射光长的拉曼光 C．波长比入射光短的瑞利光 D．波长比入射光短的拉曼光
荧光分析仪器的主要部件
➢激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 ➢分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管） ➢显示系统：指针式、数字式及计算机显示
二、荧光分析仪器的类型 ➢1.荧光光度计 ➢2.荧光分光光度计
➢荧光分光光度计 激发单色器
样品池
发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
It
I0
荧光分光光度计 样品池
It IF,p
I0
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
定性依据荧光光谱和激发光谱
二、定量分析
定量依据：F=Kc
1. 标准曲线法
直接荧光标准曲线法
F Fx
Cx
Cs
2.直接比较法 Fs F0 Cs Fx F0 Cx
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长 有关。 （ ）
3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。
() 4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品
溶液进行校正。
()
➢pH值 弱酸、弱碱
NH
+ 3
OH H+
OH -
NH 2
H+
NH -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
Cx
Fx Fs
F0 F0
Cs
第四节 荧光分析新技术
一、荧光新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 ➢三维荧光分析 ➢核酸分子荧光探针 ➢薄层扫描法中的荧光扫描法
荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物
▪有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环 结构的氨基酸类及蛋白质 ▪药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环； 维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) ▪中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发射的光量子数 吸收的光量子数
IF Ia
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
两种光源(紫外+可见)
空白溶液 (T=100%)
紫外无吸收 两面透光
荧光分光光度计
入射光与荧光垂 直方向
一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%)
低荧光材料 四面透光
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池