小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞(primary astrocytes)是从胶质细胞含量较高的组织(如大脑皮层)中分离得到的。
其细胞培养方法如下:
1. 将新鲜脑组织剖出,用积聚素/液体软膜法(trypsin/liquid membrane method)进行酶解,使得细胞可以分离开来。
2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤,然后放置在含有足够营养物质的培养基中,如DMEM。
3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内,以提供最适宜的环境和养分。
4. 在培养初期,需要添加适当比例的血清(如胎牛血清),以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。
但在细胞数目增长到一定规模后,可将血清浓度逐步降低,以避免胎牛血清对实验结果的影响。
5. 定期更换培养基,以保证细胞在最佳的生长状态。
6. 如需进行实验或操作,需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中,并按照操作所需加入相应的药物或物质。
注意事项:
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤,比如抽吸和强烈摇动。
2. 在移入滴定皿或其它操作容器时,需要注意细胞的密度,以避免过于稀疏或过于密集。
3. 在更换培养基、加药等操作时,需要十分温和,以避免对细胞造成伤害或死亡。
星型胶质细胞文档
3.厡代星形胶质细胞的培养和纯化(1)取新生1天内的wistar大鼠,全身浸入75%酒精中消毒4-5min;(2)在无菌操作台内采用无菌方法迅速取出大脑,置于一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中(置于冰上低温操作),洗掉大脑表面的血液; (3)然后将大脑放入另一盛放无菌D-Hank’s液的玻璃培养皿中,小心用软毛刷刷掉软脑膜;(4)剪取大脑皮层组织,放入另一盛放0.125%胰酶(2ml)的玻璃称量瓶里,用眼科剪将所取组织剪成小块,盖上盖子,放入培养箱内37℃下消化15min;(5)取出消化后的组织,加入2ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰酶消化,用巴士德吸管反复吹打组织至无肉眼可见组织块的浑悬状态,经直径70μm的钢质筛网过滤;(6)然后将细胞悬液在低温(4℃)离心机中离心(1000rpm,5分钟) 后去上清,细胞沉淀加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液;(7)计数后以1×106个/m1的细胞密度接种于0.lmg/ml多聚赖氨酸包被过的塑料培养瓶中;(8)放于饱和湿度培养箱中培养(37℃,5%CO2,95%空气)。
第二天换液,以后每3天换一次液直至汇合;(9)细胞汇合后(约第6天)后在37℃恒温摇床振摇(150rpm)1小时,弃上清以纯化星形胶质细胞;(10)用D-Hank’s液涮洗细胞,后用含0.25%的胰酶的D-Hank’s液消化约5分钟后,加等量含血清培养基终止消化,吹悬细胞,以1:2传代种于新的塑料培养瓶;(11)两次传代后接种于铺有包被过盖玻片(0.lmg/ml多聚赖氨酸包被)的六孔板中(用于免疫组化),或直径为100mm培养皿(用于流式细胞仪检测或Western blot检测)。
4.星形胶质细胞氧糖剥夺和复氧(OGD-R)培养同一代的原代皮层星形胶质细胞分组进行OGD-R损伤模型的制备。
将实验分为3组:正常培养对照组,OGD-R组,OGD-R+C225干预组,正常培养对照组不作处理维持在正常氧、糖、血清的状态下培养,OGD-R 组细胞用无糖无血清DMEM培养基洗涤2次,然后加入无糖无血清DMEM培养基,放入缺氧培养箱(93%N2,5%CO2,2%O2 ,37℃)中培养2小时;C225干预实验在OGD处理前加入不同浓度的C225(2µg/ml,10µg/ml)预处理1小时,然后同样用无糖无血清DMEM 培养基洗涤2次,加入无糖无血清DMEM培养基并再次加入不同浓度的C225(同前)放入缺氧培养箱中同样缺氧培养2小时;然后将各组细胞取出,换上正常糖、血清的培养基(C225组再次加入C225)放入正常氧培养箱中进行复氧,根据各组复氧不同时间(3h,6h,12h,24h)后收取细胞进行相关检测。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读,参考了众多对于小胶质细胞培养方案,对比了不同方案的利弊优缺,整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法,如有其他变更方案,以修改后为准。
1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%,0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等试剂配比:(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) (2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS (DMEM/F12无血清培养基+生长因子)25μg/ml转铁蛋白,10nM生物素,30 nM亚硒酸钠,1μg/ml putrescine(腐胺),5μg/m l胰岛素,20 nM hydrocortisone(氢化可的松),20 nMprogesterone(孕激素),1%P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF)胰蛋白酶/ EDTA 溶液0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nMhydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+Laminar flow hood Dissecting magnifying glas s Water bath at37oC Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (S terilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)2.实验步骤2.1星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。方法分子生物学
小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养。
方法分子生物学篇11.引言:介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法:详细阐述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程,包括所需的试剂、器材、具体操作步骤等。
3.结果:描述细胞分离和培养的结果,包括细胞的形态、生长情况、纯度等。
4.讨论:对分离和培养过程中可能出现的问题进行分析,对比不同方法的优缺点,并提出改进措施。
5.结论:总结全文内容,强调小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞分离和培养的成功,并展望其未来应用前景。
正文小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养在神经科学研究领域具有重要意义,为研究神经系统疾病的发生和发展提供了有力的实验基础。
本文旨在详细介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养方法。
实验前,需准备所需的试剂和器材,包括DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、离心管、培养皿等。
接下来,通过一定的操作步骤,将小鼠大脑皮层组织消化、离心、重悬,并在培养皿中进行培养。
培养过程中需注意观察细胞的生长情况,定期更换培养基,保持细胞的良好状态。
经过一段时间的培养后,可观察到细胞形态清晰,生长良好。
通过免疫荧光染色等方法,可鉴定细胞的纯度较高,证明分离和培养方法的有效性。
同时,需对分离和培养过程中可能出现的问题进行探讨,如细胞污染、细胞死亡等,并提出相应的解决措施。
与其他方法相比,本方法具有操作简便、细胞纯度高等优点。
通过熟练掌握此方法,可为神经科学研究提供稳定可靠的实验数据。
篇21.引言:介绍小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的重要性和研究背景。
2.材料与方法:详细描述小鼠大脑皮层神经元和星形胶质细胞的分离和培养过程,包括所需试剂、器材、操作步骤等。
3.结果与讨论:展示细胞分离和培养的结果,并探讨相关分子生物学特征及其意义。
4.结论:总结全文内容,强调研究价值,并提出展望。
正文引言小鼠作为常用的实验动物模型,在神经科学研究领域具有重要地位。
小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立
万方数据184物中心提供;DMEM干粉购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶(Tryp-sin)、青霉素一链霉素均为Sigma公司产品;D—Hankg液为实验室自配;MouseAnti-GFAP单克隆抗体及CY5Anti.Mouse荧光二抗购自Chemicon公司;Hoechst为Sigma公司产品。
2.原代培养①取1—3d的新生ICR小鼠,将其断头处死,在无菌条件下由腹侧取出脊髓,置盛有D—Hankg液的小皿中,在解剖显微镜下剔除脊膜,随后换到另一干净的小皿中。
②在小皿内剪碎脊髓,大小为1×1×1,再将其移人尖底离心管中,加2~3倍体积的0.25%胰蛋白酶,在37℃下消化15min,加入等体积的含血清培养基(不含抗生素)终止消化;轻吹20次左右,静置片刻,将上清吸人另一离心管中,原离心管中加入1mlD—Hankg轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中,在原离心管中加入l~2ml的0.25%胰蛋白酶再次消化15min,终止后连同上次消化的上清液一起1500rpm离心5min,弃上清液,再加入含10%血清的DMEM培养基,机械吹打使细胞分散,制成单细胞悬液。
③血细胞计数板计数后调整密度到l×105接种于无底物黏附的25cm2玻璃培养瓶,在37℃,5%CO:培养箱中培养。
④每天倒置显微镜下对细胞进行观察,接种24~48h后细胞第一次换液,以后每周换液两次。
3.星形胶质细胞的纯化细胞培养7~10d待细胞分层生长后,置于37。
C摇床中200r/min振荡6h,弃含脱落细胞的细胞悬液,D-Hankg液洗3次,加入含10%血清的DMEM培养基,放入37℃,5%CO:培养箱中继续培养。
为提高星形胶质细胞的纯度,可在传代后约5—7d细胞融合时,再次放人摇床中振荡,重复上述操作。
4.传代培养①取已培养15d左右的原代培养物,吸去旧培养基,用D—Hank童液洗2次,然后滴加4001zl0.125%胰酶一EDTA,倒置显微镜下观察,待细胞回缩,细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消化,并轻轻左右摇动培养瓶,随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液,分别接种于另两个25cm2的培养瓶,在37℃,5%C02条件下培养。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
精心整理
胶质细胞原代培养及纯化
2.1原代胶质细胞培养
1)于细胞培养前1d ,用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶,置5%CO 2培养箱中6h 以上,使用前用HBSS 液冲洗3次,备用;
2)1d 内的新生C57小鼠4只,置入75%乙醇中消毒后断头处死,75%乙醇中漂洗一次,迅速转移至预冷的HBSS (可加入双抗)中,弯镊从鼻部固定住头部,迅速剪开皮肤,换剪刀,从正中线剪
3HBSS 洗337℃4567)2008)91011胶质细胞;底层即是纯度较高的星形胶质细胞,收集小胶质细胞,离心重悬,接种于35mm 圆皿中;星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1:2传代,待长满后用于实验。
一般使用17~30d 内的星形胶质细胞。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官,经过清洗、剪切、分散等步骤后,立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤:1. 实验前准备:在超净工作台或生物安全柜中进行,确保无菌环境。
2. 取材:选择健康的成年小鼠,使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒,将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔:取出小鼠,将其放在不锈钢手术盘中,用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织:小心将所需组织从体内取出,放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织:用70-75%酒精擦拭培养皿外周后,将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中,用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织:在体视显微镜下操作,用无菌手术器械去除多余组织,用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织:将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中,用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次,然后用1ml枪头的吹打组织,最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散:将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤,切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞:在1200rpm、4℃下离心10分钟,弃掉上清液,加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞:将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中,置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项:取材过程应在无菌环境中进行,确保整个过程不受到污染。
操作时要小心,避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定,包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况,及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤,具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料,并咨询专业人士的建议和指导。
原代细胞分离纯化SOP
原代肝细胞分离纯化SOP1、实验目的分离和纯化原代干细胞,体外研究药物对原代肝脏细胞的毒性2、实验方法实验材料:ICR小鼠(20-30g)实验试剂:20%乌拉坦或水合氯醛0.1%肝素钠(Glucose 0.2g,0.125mM EDTA 8Ml,肝素钠0.2g,1Mm HEPS 4.6Ml)0.025%胶原酶(胶原酶12.5mg,L-15无血清培养基50Ml)Pecoll分离液:9份Pecoll+1份10×D-PBS(PH7.4)制成分离液。
3、实验步骤:1.ICR小鼠禁食过夜。
2.取ICR小鼠,用20%乌拉坦或水合氯醛0.2-0.3ml腹腔麻醉。
3.10-15min后固定小鼠,75%酒精消毒腹部后正中切开打开腹腔并更换器械。
4.显露肝门静脉并游离2-3cm;显露游离肝下腔静脉2-3cm,置一结扎线,暂不结扎。
5.穿刺针插入肝下腔静脉后立即结扎固定,尽快接通硅胶管并启动蠕动泵(无泵,输液器亦可)同时剪断肝门静脉远端。
6.从门静脉入肝素,使小鼠全身肝素化,并持续灌注至肝脏呈米黄色。
7.换肝素钠为胶原酶消化液(37℃预热)循环灌注消化,至肝质变软,压之凹陷不易恢复。
8.停止灌注,小心剪取个肝叶置入消毒平皿内,加入约20mlDMEM 培养基(含血清,4℃预冷)祛除纤维结缔组织,制成混合肝脏细胞悬液。
9.200目筛网过滤入15ml离心管,100rpm离心5min。
去上清,沉淀加入DMEM培养基(含血清,4℃预冷)7ml重悬。
10.取等体积肝细胞悬液悬浮于Pecoll分离液,颠倒混匀。
11.4℃1000rpm离心10min,弃上清液,用PBS清洗肝细胞2次,4℃1000rpm离心10min。
12.肝细胞沉淀加入(含血清)重悬为3ml,取适量计数并用台盼蓝(3:1)判断活率。
13.活率在90%以上的肝细胞按2×103细胞密度接种于96孔板,每孔加入100ul DMEM培养基,于37℃ 5% CO2条件下培养24h。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养1)于细胞培养前1d,用0.05% PLL(or PLO)包被培养瓶,置5% CO2培养箱中6 h以上,使用前用HBSS液冲洗3次,备用;2)1d内的新生C57小鼠4只,置入75%乙醇中消毒后断头处死,75%乙醇中漂洗一次,迅速转移至预冷的HBSS(可加入双抗)中,弯镊从鼻部固定住头部,迅速剪开皮肤,换剪刀,从正中线剪开颅骨,弯镊向两边剥去颅骨,去小脑,将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中;3)解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中,用HBSS洗3次,留少量刚好盖过组织,用眼科弯剪剪碎组织(越碎越好),加入0. 25%胰酶2mL,于37℃水浴中消化7 min,消化过程中摇晃离心管数次,使消化均匀;4)加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化;5)使用玻璃滴管或1mL枪头吹打(可将其头部略剪一部分,以扩大口径),若一次取的动物只数多,由于液体过多,可使用5mL枪头进行吹打,但因其吹打力度较大,操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多;6)吹打过程采用分步吹打法,每吹打15~20下,静置1~2min,吸取上清,以避免已消化出的单细胞被过多吹打,该过程重复3次;7)200目筛网过滤至50mL离心管中,去除残余的组织块;8)1000 r/min×5min,弃上清;9)调整细胞数为1~2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL;10)接种24 h后换以新鲜完全培养基,以除去悬浮死亡的细胞及碎片;11)细胞每3 d更换培养液,培养10~12d左右细胞基本铺满瓶壁,进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行,将培养瓶放入恒温振荡器中,37℃180rpm振荡5 h,上层疏松贴壁的为小胶质细胞;底层即是纯度较高的星形胶质细胞,收集小胶质细胞,离心重悬,接种于35mm圆皿中;星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1:2传代,待长满后用于实验。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码(GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968)胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上,使用1)于细胞培养前1d,用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶,置5%CO2前用HBSS液冲洗3次,备用;2)1d内的新生C57小鼠4只,置入75%乙醇中消毒后断头处死,75%乙醇中漂洗一次,迅速转移至预冷的HBSS(可加入双抗)中,弯镊从鼻部固定住头部,迅速剪开皮肤,换剪刀,从正中线剪开颅骨,弯镊向两边剥去颅骨,去小脑,将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中;3)解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中,用HBSS洗3次,留少量刚好盖过组织,用眼科弯剪剪碎组织(越碎越好),加入0.25%胰酶2mL,于37℃水浴中消化7min,消化过程中摇晃离心管数次,使消化均匀;4)加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化;5)使用玻璃滴管或1mL枪头吹打(可将其头部略剪一部分,以扩大口径),若一次取的动物只数多,由于液体过多,可使用5mL枪头进行吹打,但因其吹打力度较大,操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多;6)吹打过程采用分步吹打法,每吹打15~20下,静置1~2min,吸取上清,以避免已消化出的单细胞被过多吹打,该过程重复3次;7)200目筛网过滤至50mL离心管中,去除残余的组织块;8)1000r/min×5min,弃上清;9)调整细胞数为1~2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL;10)接种24h后换以新鲜完全培养基,以除去悬浮死亡的细胞及碎片;11)细胞每3d更换培养液,培养10~12d左右细胞基本铺满瓶壁,进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行,将培养瓶放入恒温振荡器中,37℃180rpm振荡5h,上层疏松贴壁的为小胶质细胞;底层即是纯度较高的星形胶质细胞,收集小胶质细胞,离心重悬,接种于35mm圆皿中;星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1:2传代,待长满后用于实验。
小鼠星形胶质细胞的培养
星形胶质细胞的培养星形胶质细胞,是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞,也是胶质细胞中体积最大的一种。
用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形,从胞体发出许多长而分支的突起,伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间,起支持和分隔神经细胞的作用。
细胞突起的末端常膨大形成脚板或称终足,有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上,因此这些脚板又被称为血管足或血管周足,靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面,彼此连接构成胶质界膜。
那么星形胶质细胞如何进行培养呢,下面介绍下此细胞的培养方法。
一、实验器械和试剂器械有剪刀、小镊子、小毛刷等,试剂DMEM/F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿等。
二、星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只(出生24h),在无菌条件下断头,迅速剪开颅骨,取出脑组织与预冷的PBS液中反复冲洗以去除血污,再移入另一盛有PBS的培养皿中,用小毛笔轻轻刷去脑组织表面的脑膜和血管,用PBS冲洗后剪去脑干仅保留大脑半球,用小剪刀充分剪碎脑组织,加入比组织块总量多30-50倍的0.05%胰蛋白酶,再移入50ml的离心管中,用吸管反复吹打消化至无明显的脑组织块为止,然后加入DMEM/F12完全培养基(含10%的胎牛血清、100U/ml青-链霉素)终止消化,反复吹打制成单细胞悬液,1000r/min离心5min,弃去上清液,加入一定量的完全培养吹打成单细胞悬液,接种到培养瓶中,置于细胞培养箱中培养,3-4h后更换一次培养液,以后每3天换夜一次,注意观察细胞的生长情况。
三、星形胶质细胞的分离和纯化将培养于培养瓶中的混合胶质细胞培养液弃去,用PBS清洗2遍,加入0.25%的胰酶于培养箱中消化,在镜下观察至细胞脱落,然后加入完全培养基终止消化,1000r/min离心5min,将细胞沉淀重悬接种于培养瓶中,置于培养箱中培养,稳定1天后,再恒温摇床200r/min振摇2h,吸取上清液(去除一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞),贴壁细胞用0.25%的胰酶消化,方法同上,然后用完全培养基重悬接种到培养瓶中,稳定1天后用于后续实验。
小鼠肝星状细胞的分离纯化新方法的建立与应用
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小鼠原代星形胶质、神经元和小胶质细胞培养方法
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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞(astrocytes)是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞,主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。
原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。
以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。
实验材料和仪器:1.小鼠(新生仔小鼠)2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤:1.小鼠的准备:a.使用新生仔小鼠,从母鼠的子宫中取出。
b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中,用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。
c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中,并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。
2.细胞分离:a.将离心管架放在显微镜下,用显微针将脑组织均匀挫碎。
b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。
c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I,37°C孵育30分钟。
d.轻轻吸入含有酶切的脑组织,并用吸头轻轻洗涤脑组织,收集上清液。
e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤,除去大颗粒的细胞。
3.细胞培养:a. 将滤过后的细胞悬液计数,计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。
b.取DMEM/F12培养基,添加10%FBS,将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。
c.在培养皿中加入5%CO2,37°C孵育。
d.每两天更换一次培养基,直到细胞至80%~90%的密度。
4.纯化小鼠星形胶质细胞:a.将培养皿中的细胞收集到离心管中,进行离心。
b.用无菌生理盐水洗涤细胞,去除不附着的细胞和残留的培养基。
c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮,计数并计算细胞密度。
d.用磁层细胞分选仪,通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择,分离纯化小鼠星形胶质细胞。
星形胶质细胞原代培养
新生1-2天Wistar大鼠乳鼠,经75%酒精消毒,断头处死,取脑放入冷的D-Hanks平衡盐溶液,去除脑膜及大血管。
分离两侧大脑皮质并剪成1mm 3 大小,加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min,用含10% FBS的DMEM培养基终止消化,离心1000rpm 10min,去上清,再用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀.经75m筛网过滤,收集滤液,离心1000rpm 10min,收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,调整细胞密度至1.5106/ml,种植于75cm 2 培养瓶,经1小时差速黏附去除成纤维细胞后,将细胞悬液转移到一新的75cm2培养瓶继续培养,两天换液一次。
7天后将培养瓶放入水平摇床,260rpms 2小时37℃,换液弃除小胶质细胞,放入培养箱平衡1小时,重新置于水平摇床,260rpms 18小时37℃,换液弃除少突胶质细胞,用新鲜培养基洗2遍,加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA1:1混合液消化、传代备用。
小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法的建立及鉴定
小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法的建立及鉴定姚云;戈果【期刊名称】《饮食科学》【年(卷),期】2018(0)9X【摘要】目的:建立小鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外原代培养方法,为进一步研究星形胶质细胞奠定基础。
方法:取新生24h内ICR小鼠大脑皮质进行体外原代培养,采用免疫细胞化学法检测星形胶质细胞特异性标记蛋白—胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定原代培养的星形胶质细胞。
结果:原代培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长良好,原代培养至第14天以后星形胶质细胞纯度达95%以上。
结论:本研究建立的星形胶质细胞体外原代培养方法能获得较高纯度的星形胶质细胞,且操作简单、可靠。
【总页数】2页(P257-258)【关键词】ICR小鼠;星形胶质细胞;原代培养;鉴定【作者】姚云;戈果【作者单位】毕节医学高等专科学校人体解剖学教研室,毕节贵州551700;贵州医科大学人体解剖学教研室,贵阳贵州550025【正文语种】中文【中图分类】R-33;Q813.1【相关文献】1.小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立 [J], 黄艳丽;李春岩;许蕾;段伟松;蒋怡芳;姜虹;郭艳苏;范志亮;张瑞燕;任文博2.新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及鉴定 [J], 罗湘颖;陈成;邓永文;陈风华;黄永凯;方芳;高俊玮;柳浩然;毕长龙;曾飞跃;周仁辉;芦明3.新生小鼠大脑皮质神经细胞体外培养方法及鉴定 [J], 娄磊;胡晓;朱加应;万兴;王建怡4.新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及鉴定 [J], 罗湘颖;杨志敏;王廷华;刘苏;赵匡彦5.新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定 [J], 梅莉;路浩;刘宗平;何玉琴因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
《小鼠精原干细胞分离、纯化与去分化研究》范文
《小鼠精原干细胞分离、纯化与去分化研究》篇一一、引言近年来,小鼠精原干细胞的研究已成为生物学领域的重要课题。
精原干细胞作为生殖细胞的前体,其分离、纯化与去分化研究对于理解生殖细胞发育机制、治疗不孕不育症以及探索再生医学具有重要意义。
本文旨在研究小鼠精原干细胞的分离、纯化及去分化过程,以期为相关研究提供理论基础和实验依据。
二、材料与方法1. 材料实验所需小鼠精原干细胞、培养基、酶类等均需符合实验要求,并经过严格的质量控制。
2. 方法(1)小鼠精原干细胞的分离本实验采用酶消化法对小鼠睾丸组织进行消化,得到单细胞悬液。
通过离心和差速贴壁法,将精原干细胞从其他细胞中分离出来。
(2)小鼠精原干细胞的纯化采用流式细胞术对分离得到的细胞进行纯化,通过特定标记的抗体筛选出精原干细胞。
(3)小鼠精原干细胞的去分化研究将纯化后的精原干细胞进行体外培养,通过添加特定因子和调整培养条件,诱导其去分化为多潜能干细胞。
三、实验结果1. 小鼠精原干细胞的分离结果通过酶消化法和差速贴壁法,成功从小鼠睾丸组织中分离出精原干细胞。
在显微镜下观察,可见细胞形态均一,且具有较高的纯度。
2. 小鼠精原干细胞的纯化结果采用流式细胞术对分离得到的细胞进行纯化,筛选出具有特定标记的精原干细胞。
纯化后的精原干细胞纯度较高,为后续实验提供了可靠的实验材料。
3. 小鼠精原干细胞的去分化研究结果将纯化后的精原干细胞进行体外培养,通过添加特定因子和调整培养条件,成功诱导其去分化为多潜能干细胞。
在显微镜下观察,可见细胞形态发生变化,具有多潜能干细胞的特征。
通过分子生物学技术检测,证实了去分化成功的结果。
四、讨论本研究成功实现了小鼠精原干细胞的分离、纯化与去分化。
在分离过程中,采用了酶消化法和差速贴壁法,有效地将精原干细胞从其他细胞中分离出来。
在纯化过程中,通过流式细胞术和特定标记的抗体,进一步提高了精原干细胞的纯度。
在去分化研究中,通过添加特定因子和调整培养条件,成功诱导精原干细胞去分化为多潜能干细胞。
小鼠小胶质细胞原代培养方法!
6、0.4%台盼蓝溶液的配制 台盼蓝 4 g PBS 少许(研磨) PBS 定容至 100ml,滤纸过滤,室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制: 多聚甲醛 4 g PBS 溶液 100ml 加热至 60,边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌,至液体澄清。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
(1) 75%(体积分数)酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠,在无菌条件下断头,剪开头皮及颅骨,取出脑组织,置于盛冷的pH7.2,无 钙、镁的D-Hank's液的平皿中(下置冰袋)。
(2) 无菌剥离脑组织,除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层,仔细剥离脑膜及血管。 (3)用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块,0.125%胰蛋白酶消化,37作用 20min,期间振摇 2~3 次。 (4)弃去上清液,加入完全接种液终止消化,漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块,静置 2min。 (5)悬液收集于新的离心管,离心(1000r/min,10 min,4),弃去上清液。加入完全培养液重悬,200 目不锈钢网过滤。根据实验需要 接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。 (6)置 37、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基,以后每3d换一次液,并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
(3)离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清;加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于 CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。
小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较
小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较【关键词】星形胶质细胞;,离体培养;,反应性星形胶质细胞;bystin[摘要]目的: 比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法,旨在获得高纯度的星形胶质细胞,为进一步研究奠定基础。
方法: :用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。
结果: 原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99%以上,bystin表达量较少,且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多,GFAP免疫荧光变亮,能耐受长时间模拟缺血,提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。
结论: 经过传代Na3VO4, NaF是磷酸酶抑制剂,如果你作的蛋白是磷酸酶建议不要加。
Aprotinin, leupeptin, pepstatin是蛋白酶抑制剂比较昂贵,如果没条件,只加PMSF也可以,但必须严格操作,防止蛋白降解。
提取的蛋白放-70保存。
纯化的星形胶质细胞纯度最高,可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞,因此能更好地反映其在脑中的功能,是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。
[关键词]星形胶质细胞; 离体培养; 反应性星形胶质细胞;bystinT o establish a cultural method of astrocytes by comparison of different ways of isolation astrocytes from mouse cerebralDU Fang,WU Xiao-mei,ZHU Li(Institute of Nautical Medicine,Nantong University,Nantong Jiangsu 226001,China)[Abstract]Objective: Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to establish an optimal culture method of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods: To acquire purified astrocytes by four usually used cultural methods: primary culture,subculture for three times,shanken overnight once or twice. Results: The purity of primary culture was the lowest,with the method of being subcultured for three times the purest,appear>99% pure. The expression of bys- tin was low and cell ability could be enhanced by short-timed simulated ischemia with the subcultural meth-od. Astrocytes purified by being shanken overnight once or twice highly expressed bystin,immunocytochem-ical staining with anti-mouse GFAP was brighter and could endure simulated ischemia for longer time,which demonstrated that the astrocytes might have been activated by shaking. Conclusion: With the subcultural method we can acquire the purest astrocytes in vitro,which can be induced to reactive astrocytes by simula-ted ischemia,and can best reflect their functions in the brain. It′s an optimal method to acquire the astro-cytes for future study of their functions in vivo and reactive astrocytes.[Key words]astrocyte; in vitro; reactive astrocyte; bystin在中枢神经系统中,胶质细胞是主要的组成部分,其中星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多种作用,组成血脑脊液屏障,营养和支持神经元,与神经元突触的发生有着密切联系[1]。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞,具有重要的生理功能。
进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。
实验步骤:1.小鼠主星形胶质细胞原代培养(1)准备培养基:将DMEM/F12培养基配制好,添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素(P/S)和20ng/mL生长因子(如EGF和bFGF),混匀即可。
将培养基过滤灭菌。
(2)小鼠灭菌和解剖:选取3-5天龄的小鼠,进行表面消毒处理,解剖小鼠颅脑组织。
(3)组织分离:将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中,使用去髓针将组织剪碎,加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。
(4)消化组织:使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化,将组织置于37°C的恒温槽中,用胶性吸管轻轻吹泡,约30分钟后停止消化。
(5)细胞分离:用离心机将细胞分离,将上清液收集到新的离心管中,用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。
(6)细胞计数:用显微镜观察细胞形态,进行细胞计数。
(7)细胞培养:将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中,加入预先配制好的培养基,放入培养箱中,37°C、5%CO2培养。
2.小鼠星形胶质细胞分离纯化(1)胶质细胞去除:在培养2-3周后,使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去,以保留星形胶质细胞。
(2)非星形胶质细胞去除:使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯,将细胞悬浮液转移到离心管中,使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来,再次离心。
(3)细胞计数和分装:用显微镜观察细胞形态,进行细胞计数并分装到新的培养皿中。
(4)鉴定纯化程度:使用免疫细胞化学方法,如免疫荧光染色,检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平,以确定纯化程度。
(5)细胞培养:将纯化后的星形胶质细胞继续培养,并进一步进行功能和机制的研究。
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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方
案
经过相关文献阅读,参考了众多对于小胶质细胞培养方案,对比了不同方案的利弊优缺,整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法,如有其他变更方案,以修改后为准。
1. 实验材料与试剂
剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%,0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO
恒
2
温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等
试剂配比:
(1) DMEM 10:10:1
DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)
(2) DMEM 5:5:1
DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S
(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS(DMEM/F12无血清培养
基+生长因子)
25μg/ml转铁蛋白,10nM生物素,30 nM亚硒酸钠,1μg/ml putrescine(腐胺),5μg/m l胰岛素,20 nM hydrocortisone(氢化可的松),20 nM
progesterone(孕激素),1%P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF)胰蛋白酶/ EDTA 溶液0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS
DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)
Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+
Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at
37ºC Humidified tissue culture incubator (37ºC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20)
Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004)
T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin)
30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)
2.实验步骤
2.1星形胶质细胞的混合培养
取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种
恒温细胞培养箱( 37度) 培入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO
2
养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
2.2星形胶质细胞的分离和纯化
将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去,用0.01mol/L PBS 洗2遍。
用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶,37℃消化15 min 左右,至镜下观察到大部分星形细胞脱落,将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培养基中止消化,1000 r/ min离心5 min,再用PBS 洗2 遍后,重悬于含10% FBS DMEM/F12 培养基中,种于培养瓶中; 将培养瓶置于37℃细胞培养箱稳定贴壁1 d 后,再用37℃恒温定轨摇床,200 r/min 振摇2 h;吸取上清液弃去(其中主要包括一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞) ,贴壁细胞采用0. 25% 胰
酶37℃消化后立即置于含10% FBS DMEM/F12 培养基中,终止消化后,1000 r/ min 离心5 min,弃上清,将沉淀细胞重悬于含10%FBS的DMEM/F12 培养基,计数后调整细胞密度106 /孔接种于6 孔培养板中,稳定24 h 后可用于后续实验。
2.3星形胶质细胞的免疫细胞化学染色鉴定
本实验建议选择OX42作为小胶质细胞的标志物, 能同时反映小胶质细胞的激活状态,以OX42抗小鼠CD11b/c抗体免疫荧光染色法鉴定星形胶质细胞。
具体步骤:
(1)待小胶质细胞长成片后, 取出盖玻片, 依次用PBS液清洗3次,每次5 min, 冰丙酮固定15 min, 干燥5 min, PBS漂洗3 次;
(2)特异性抗体:按照说明书稀释比要求稀释抗体,加入抗体,放置37℃孵育60min,进行抗体标记。
(3)洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次/15 分钟,晾干。
(4)加入荧光标记抗体,37℃孵育30min。
1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次/15 分钟,晾干。
(5)封片:封片剂封片。
(6)镜检:荧光显微镜下观察,胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光,细胞核周围尤其明显。
注意事项
1、选材注意选取新生小鼠(24h内)。
取材过程尽可能保证无菌,尽量剔除脑膜及血管和海马部分。
2、注意尽可能消除脑组织表面的残血,避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。
3、应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
4、严格控制胶质细胞培养条件。
包括细胞培养用液(培养基,生长因子,血清,抗生素)的质量,浓度。
5、关于培养瓶包被与否,有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。
实验中,可以酌情考虑是否包被。
6、传代培养细胞接种量为1×106个(25 cm2培养瓶),细胞倍增时间为36小时。
细胞传代培养最佳为5-8代,传代次数增加,细胞体积增大,细胞之间间隙增加,细胞贴壁牢固,传代消化时间会有所延长。