葡聚糖凝胶层析_蛋白质脱盐实验的技术改进

,
,
加 入 柱 内 再将 柱 垂 直 固 定 在 铁 架 台上 用 少量 洗 脱 液 冲 洗 管 壁 稳 定 下 沉
.
10m i n
,
柱 高 一 般在
平街 加样
调 节恒 流 泵 选 择
,
,
。 7 一 lm
.
i 的 流速 以 2 倍 床 体 积 的洗 脱液进 行平 衡洗 / m n l
,
脱
1
.
。
2 4
,
,
、
床均 匀 无 节 无 气 泡 并 适 当增 加 了柱 床 高 度 对提 高 层 析 效率 有 一 定 的 作 用
术 洗 脱 速 度也 进 行 了 改 进
,
、 。
、
,
。
同 时对 加样 技
,
在 加样 时 采 用 加皮 头 移 液 管轻触 床 面 加样 法 样 品 能均 匀 扩散
。
,
,
又 不 致 冲坏 床 面 对 提高 层 析 效 率也 起 了 一 定 作 用
,
, , , , ,
。
,
。
,
,
另 外 我 们还 对 样 品 浓 度 和 用 量 进 行 了 试 验 其 结
,
果是 样 品过 浓 量 过 大 其 粘 度 大 相 互 粘 合 不 易 分
离 但 样 品 过 稀 量 过 少 时 由于 分子 扩 散 作 用 也 得 不
到 好 的分 离 效果
. 3 3
。
,
,
;
, ,
拜
, ,
当
a
不 变 时 增 大 1 R 变 大 相对 层 析 谱 来 说 也 就 是 增
, , , , , , ,
灯
一V
e l
.
因此 在 层 析 时 增 加 柱 长 则 有 利 于 峰 的 公 离 能提 高 层 析 效 率 但 也 不 能 无 限 地
, ,
增 加 柱 长 因 为 柱过 长 层 析 时 间 长 样 品 易 扩 散 增 大 了
二
从
V
e Z
V e 一V e _ K ~ 一 一二二二 一一 看
_
,
.
、,
,
_
_
_
_
_
e :
,
、 _
,
.
_
‘
_
,
任U
增大
V
,
e
Z
一V
尺
; 变 大 相 邵 网 峰易 分 禺 相 反 减 少
, ,
。
_
.
_
_
_
.
_
_
一V
e ,
,
则
R
变 小 峰 易 重 迭 层 析 效率 低
( )
,
,
依 公式
V
e Z
卜 告宁
lo m i n
, , , ,
去 上 清液 最 后 用
0 5m l
.
的速 度 离 心
速度 去 上 清 液 于 洗净 的 红 细 胞 中加
Z0 0 0 r / m i n
等 体 积 的 蒸馏 水 和
,
四 氯化 碳 剧 烈 振荡 使血 球 全 部 溶 血 用 皮 头 滴 管 吸 出 上 层 的 红 色
。
,
。
量 被分 离物 分 离好 坏 的重要 标志 其 表示 方 法 有 两 种 “ 兰 “) l 一 当y 卫二 R 一
舍 瑞
1
一了
,
轰
、
树 里
,
添
( 2 )R =
a
气
一 1
a
,
任
: a
式中
2丫
-
V V
—
eZ ei
,
少 丫 IV
eo eo
~
一 V 一 V
一
~ :-
l
, ,
h
l 一 柱长 h 一 理 论 塔板 高度 N 一 有效 理 论 塔 板 数 ) (
汤 菊香
郭 素萍
( 淮 阳县 农牧 局 )
、
(农 学 系 新 乡 4 5 3 0 0 3 )
摘要
葡 聚 糖凝胶 层 析 法 进 行 蛋 白质脱盐 的实验 中 对 常 规实验方 法 中 的 装柱 技术 洗脱速 度 作
。
,
了 部分改进
在用
68
n 0
;
m
波 长 比 色 时 发 现 一 个与血红 蛋 白峰平 行 的 未 知 峰 通 过大 量 实 验 验证
3
・
。
2
加样 与 层析 效 率
原 实验 要 求 用 吸 管 吸 取
,
。
0
.
sm l 样 品 加 到 床面 上
,
,
但
用 此 法 加 样 易冲 坏 床 面 造 成 区 带 参 差 不 齐 影 响 分 离
效 果 为 此 进行 了 加样方 法 的 改进 用 皮 头 移 液 管 加 样 容 易 控 制 加 样 速 度 一 般 不 破坏 床 面 样 品 能均 匀 地 扩 散 区 带 整齐 得 到 的分 离效 果 较好
透 明液 即 为血 红蛋 白溶液
收稿 日 期
:
19 4
一
6 0
一
1 2
.
硫酸 铜 盐 溶液
:
称取
N
a Z
3
.
7 3g C u S O
,
‘
溶于
6om l
,
lo m l
热 蒸馏 水 中 冷后 稀 释到
,
,
1 5 m l;
u
7 再 称柠 檬 酸钠 1
.
39
,
eO
。
・
Z H O iog
,
加水
热溶解 后 冷 却 稀释 至
.
切 断恒 流 泵 打 开 柱 底 出 口 放 洗脱 液 至 胶 床 面 齐 关 闭 下 口 取 sm L 样 品 使
, , ,
,
移 液 管 尖 端 慢 慢地 接触 到 床 面 轻轻 挤 压 皮 头 使 样 品 放 入 床 内 再 用 l l m 的洗脱液 冲洗管 壁
, , ,
2 1
.
次 最后 加 洗 脱 液 约 5 ~
,
。
丫e
.
离 度 而 分 离 度 与柱 床高 度有着 密 切 的关 系 首 先
。
从 层析 谱 上 看 如 图
,
2
所 示 这是 两 种被 分 离物 从
,
。
层 析 柱 上 洗 脱 下 来 的 正 态 分 布 曲线 V e 代表 第 一
l
丫/
图 2
,
种 物 质 从 加 样 开 始 到 峰 顶 出现 所用 的 洗脱 体积
。
.
根据 这 种 猜测 我 们首 先 用 化 学 的方 法 对 层 析 出 来的 红 色 溶 液 进行 验证 取 待测 的红 色 溶
,
,
液
Zm l
Байду номын сангаас
,
加
0
.
n 1 浓 度 的 葡 萄 糖 Z m l 在 沸水 浴 中加 热 s m i 0
, ,
,
如 有铜 盐 存 在 时 就 有 黄 红 色沉 淀
。
,
u 生 成 (C O 十) 但 结果 没 有 这 种 现 象 发 生 这样 就排 除 了红 色 溶 液 中有 铜 盐 的 存 在
,
。
第一 此 峰 可 能 是分 离 不 佳 红 色 溶 液 中 仍 有
铜 盐 存在 的 缘 故
,
。
,
图
1
.
1
洗 脱 曲线
52 68
血 红 蛋 白在 硫 酸铜 盐 在 未知 峰
n m 处的吸收峰 0 n 0
m
。
第二 也 可 能 此 峰是 血 红 蛋 白在
吸收
。
680 n m
处有
2 3
.
处 的吸 收 峰
,
波 长 分 别为
1 3
.
68on m
・
实 验结 果
根据
,
520 n m
和
680 n m l:
波 长 测 定 的 光 密 度值
。
分别 以 管数 为横 坐 标 以光 密值为 纵 坐 标进
,
行 绘 图 其结 果 如 图
2
未 知 峰 的发 现 与验 证
在实验 中 当用
, , ,
0
.
D
14
0
.
68
on
m
波 长 比色 时 测 得 的
v
e
;
Z
为 第 二 种物 质 从 加 样 开 始 到 峰顶 出 现 时 的 洗
。
层 析谱
,
脱 体积
于分 离
y
, ,
y
Z
分别代 表 两 峰峰底 的 宽度
,
,
a
为标 准差 表 示 各 组分 的 分散 度
:
a
值大 峰宽 不 利
,
,
,
占值 小
峰窄 易 分离
,
。
分 离度 R 表 示 相 邻 两 峰 顶 距 离是 两 峰 平 均 宽度 的几倍 它 是 衡
,
,
,
图
3
2 m 的 层 析谱 柱床 2c
. .
吸 收 弱 些罢 了 所 以 当用
5 2on m
,
680 n m
比色 Cu SO
。
;
时
3
一 6 管 内 因 血 红 蛋 白 存在 而 出 现 一 个 小 于
吸 收 峰 的小 峰