免疫印迹技术方法研究

免疫印迹技术方法研究

一、前言

免疫印迹技术借助的是抗体与抗原的特异性结合的作用，来检测样品中蛋白质表达情况的一项免疫学检测技术，不需要复杂的大型机器，主要依靠凝胶电泳和电转移来对蛋白质提取，最终对蛋白质进行定性定量分析。

二、内容

1、技术原理

（1）样品的凝胶电泳：制备凝胶，加入样品进行凝胶电泳，使样品中蛋白质分离。

（2）电印迹：所谓电印迹就是将凝胶电泳上的经过分离的蛋白转移到一个固相膜上。因为如果让蛋白质在凝胶电泳后直接检测，部分蛋白质会嵌在凝胶里面，探针无法到达，同时可能对蛋白质条带有破坏作用，因此为了方便探针与蛋白质互相结合，将其转移到另一个与探针结合度更好的物质上，也就是固相膜。

（3）选择性封闭：为避免探针和无关物质结合，将膜上没有结合蛋白质的部分封闭，防止其他干扰。

（4）免疫结合：将抗体与膜上的蛋白质结合，使其反应，再用二抗与一抗反应。

（5）产物检测：通过二抗间接检测目的蛋白，将膜上的抗体和能发出荧光的物质结合，

对产生的发光物质进行检测。

2、方法

(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备:把玻璃板洗净并晾干,四边对齐，置于制胶架上。其次配制分离胶，蛋白质的相对分子量不同制胶也不同。分离胶制好后沿玻璃板

上的一角缓慢、平稳地注入两层玻璃板中间,待其充分凝固后,把浓缩后的胶溶液

沿玻璃板一角注入，立刻插入梳子。

(2)蛋白样品的前处理:将缓冲液和蛋白质样品按一定比例混合,待其沸腾若

干分钟后,放入冰块中待用。

(3)样品上样和电泳:将制好的凝胶缓慢从架上取下,放进电泳槽,将缓冲液注

入电泳槽,再拔出梳子。吸取经过预处理的蛋白样品20μL加样。打开电泳槽电源,选择稳压模式,100v左右的工作电压，待电泳时加入的指示染料到达胶底部时

关闭电泳槽。经凝胶电泳处理后，样品蛋白质带负电荷，在凝胶中游动，游动速

度与分子量大小成反比，自阴极游到阳极。

（4）蛋白质转移（电转印）：将凝胶板取下,切去不用的部分,剪裁和凝胶

一样大小的NC膜或PVDF膜,再在电转移液中浸泡固相膜，裁剪数张比凝胶尺寸

稍微小一点的滤纸,放入缓冲液中浸泡。把气泡赶走，按一定的顺序放在转膜仪上。打开电源，设置成恒流模式,计算转膜需要的电流。常用的转印法有电泳印迹、点印迹、扩散印迹等。使用最广泛的是半干式电转印,方法是通电后将凝胶

上的蛋白转移到被浸湿的膜上。这种方法的条件容易控制,同时分辨率也高。

（5）封闭：取下转移膜,漂洗,在袋子中加入封闭液,赶走气泡,用仪器封口

后在置于摇床上，选择室温。封闭是为了避免固相膜和一抗的非特异性结合。样

品蛋白转移到固相膜上后,如果没有对膜上未吸附蛋白的位置进行封闭,探针会与

膜上的未吸附样品的位置产生非特异的结合,降低了结合效率。封阻物质可以选

牛血清蛋白、凝集素等。封闭液的浓度不能过高或过低，温度通常是室温。

(6)一抗与样品结合:取出封闭处理后的膜,放入另一袋子中,加入一抗液体,

赶走气泡后封口。在摇床上摇，选择室温。

(7)洗膜:用洗膜液将未结合蛋白样品的抗体液洗脱。

(8)二抗与一抗的结合:将漂洗过的膜放入干净袋子中,再加入二抗液体。在

摇床上摇，选择室温。

（9）化学发光反应检测样品：取出滤膜,晾干，将膜放入暗盒中,在膜上加

发光液,孵育两分钟,之后立刻压片。

（10）曝光和冲洗X光片：在暗盒中观察条带发光情况和光强大小的强度,

测定曝光时间，之后冲洗X光片。

3、免疫印迹在食品检验检疫中的应用

（1）食品中过敏原的半定量检测

斑点免疫印迹是将前处理好的蛋白样品加在偏二氟乙烯固相膜上，用一抗二

抗孵育，再加入底物反应，加入显色剂，可观察到有色斑点，斑点越亮说明蛋白

质含量越高。该方法可以检测食品中的过敏原如花生蛋白，是一种半定量的测定，方便且成本低。

（2）发酵水解食品的分析

使用凝胶进行分离，然后转移到PVDF膜或其他固相膜上，使用特异性抗体

进行免疫印迹。发酵水解的样品不需稀释，进行电泳分离。对标记蛋白进行预实

验染色，发现不含IgG结合位点，所以此蛋白的化学发光图像不明显，需要用成

像仪测量。在化学发光成像过程中使用了多种暴露水平，有助于观察强度较低的

蛋白条带和区分相邻的带，从而估计样品中蛋白质的相对含量。将斑点图像和化

学发光图像叠加，可估计肽和蛋白质的分子量。所有的蛋白质免疫印迹分析都进

行两次重复实验，以确保实验的准确性。

（3）对鱼类的主要过敏原帕瓦尔布特征化

鱼类中的主要过敏原之一是帕瓦尔布，它具有主要过敏原的免疫吸附功能。

准备生的和煮熟的鱼提取物。通过SDS-PAGE和2D（2-DE）电泳分离。鱼过敏患

者的1-DE 蛋白印迹血清。通过2-DE免疫印迹进一步分析血清。去除主要的过敏

性蛋白质污渍，进行消化并通过质量分析仪进行分析。来自SDS-PAGE的原始提

取物在沸腾的提取物中显示出较低的蛋白质含量。原始的2-DE提取物的凝胶特

性进一步将蛋白质带划分为不同的蛋白质斑点。原始1-DE提取物的蛋白质指纹

图谱显示，在实验中主要的过敏原是42 kDa和51 kDa的两个热激部分，而煮沸

的提取物仅显示一个结合区。被显示。是的，原始提取物的2-DE免疫印迹法还

检测到各种重要的反应点。消化点上产生的肽的质量分析表明，这些点是帕瓦尔布、肌酸激酶和乳糖酶。除帕瓦尔布外，两种新的热实验室过敏原已被确定为主

要过敏原。这项研究表明，热固醇和实验性热蛋白在对金枪鱼的局部过敏中非常

重要，应纳入诊断策略。

三、结语

免疫印迹检测是一种应用广泛、灵敏高效的检测方法，它不仅在医学上有着

应用，比如在检测HIV方面具有突出贡献，对于食品卫生与营养学上具有相当大

的作用，在食品及其食品相关检测时，可以灵敏地分析出不易检测出的物质，只

需少量试剂与比其他方法更快的孵化、洗涤时间即可进行微量物质的灵敏检验，

是判定是否存在特定的有害元素的重要依据。它是根据抗原和抗体的特异性结合

作用，对复杂样本中的某一蛋白进行检测，并对其进行半定量分析。主要用于目

标蛋白特异性表达的定性或半定量分析，后续分析蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用，鉴定和分析蛋白修饰。适用于复杂蛋白质样品中微量靶蛋白的检测，如毒素、蛋白质标记物和分子量分析。免疫蛋白检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白是被

检测物，抗体是探针，标记的二抗可以用来显色。免疫印迹的广泛的优势也包括

从复杂混合物中识别和量化特异性抗原的能力，以及单克隆抗体对多克隆抗体的

优势。