慢病毒载体的构建

Vector Titer Determination
Transduced Cells
Virions
FACS (TU/ml)
qPCR SybRGreen (proviral DNA/cell)
p24 ELISA (ng p24/ml)
IP
PP
2.HIV-1 Vector Production Supernatant recoveries & concentration
Components of the lentiviral system
Expression vector
Packaging vector
Envelop/Host Range vector
五 包装系统的设计
----- HIV-1-Derived lentiviral vector production ,concentration & titration
PACKAGING CONSTRUCT
VECTOR CONSTRUCT
ENVELOPE CONSTRUCT
1. HIV-1-Derived lentiviral vector production & titration
Tri-Transfection (CaPO4) Pseudoparticles Recovery (filtration 0.45µm)
Mitrophanous K, Gene Ther 5(11):1481–1487(1999)
Lentiviral Vector Systems Under Development
• Primate – Human immunodeficiency virus (HIV) – Simian immunodeficiency virus (SIV)
The Development of LV Vectors The 3rd Generation
Self-inactivating (SIN) vectors Further improvement in biosafety Tat was deleted Rev was put into a separate plasmid U3 of the 5’ LTR was replaced by the CMV IE promoter/enhancer The possibility of generating RCL is further reduced
Packaging Construct Transfer Vector Construct Envelope Construct All plasmids contain a SV40 replication origin --> Episomal status
293T cells
Supernatants at 48h and 72h p.t. Concentration by Ultracentrifugation
2
Pool 2
2
Store at 4°C
SW55
SW28
Pool 1
Concentration by ultracentrifugation
Pool 1 & Pool 2
3
Pool 3 Aliquots
六 The difference of Packaging Cells for LVV with other retroviruses
一 HIV-1 life cycle
二 HIV-1基因结构
• • • • • • • •
gag, -----群抗原基因，编码核心蛋白p24 pol -----多聚酶基因，编码多聚酶； env-----包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41； tat ----- 基因反式激活因子对HIV-1基因其正调控作用 rev,----- 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif,----- 病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复 Vpr,----- R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu,----- U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef,----负因子，具有抑制HIV-1增殖作用
Lentiviruses life cycle
慢病毒通过病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上的特异受体结合而 进入易感靶细胞。一旦与细胞膜上的特异受体结合，慢病 毒膜和细胞膜融合后病毒核心释放入细胞浆里。病毒RNA 逆转录合成双链线性DNA而转运之细胞核。线性病毒 DNA永久性的整合入染色体DNA（宿主基因组）中，形 成前病毒，成为永久的遗传成分，在细胞周期中与靶细胞 基因一样进行复制，转给子代细胞。前病毒DNA转录成 RNA后再转运至胞浆，在胞浆里RNA翻译成病毒蛋白。病 毒前结构蛋白和复制酶与病毒RNA组装成新的病毒核心， 从包装细胞获得病毒包膜蛋白后以出芽的方式从细胞膜上 释放出。病毒前结构蛋白经进一步处理而最终形成成熟的 具有感染性的子代病毒颗粒。这些特性是慢病毒成为基因 治疗转运工具的重要原因 。
• Non-primate – Feline immunodeficiency virus (FIV) – Equine infectious anemia virus (EIAV)
The outline of this ppt
接下来将以 HIV为例从以下方面说明慢病毒载体构建方面 的基础知识：
一. HIV-1 life cycle 二. HIV-1基因结构和病毒颗粒结构 三.载体系统构建的基本原理 四.载体系统的设计 五.包装系统的设计 ----- HIV-1-Derived lentiviral vector production , concentration & titration 1. HIV-1-Derived lentiviral vector production & titration 2.HIV-1 Vector Production----Supernatant recoveries & concentrat 六.The difference of Packaging Cells for LVV with other retroviruses 七.The Development of LV Vectors 八.Advantages and Disadvantages of Lentiviral vectors 九.The comparison of Lentiviral vectors with other vectors
二 HIV-1病毒颗粒结构
三 载体系统构建的基本原理
• HIV-1基因组中如包装信号、长末端重复序列的顺式作用元件与编码 反式作用蛋白的序列进行分离。即从病毒基因组中将反式gag, pol, and env基因(其他辅助基因省去)从病毒中分离出而用我们感兴趣的外源性 目的基因代替，剩下的顺式作用元件在病毒复制周期中------逆转录、 整合、转录和包被--------可以被其它病毒或细胞蛋白识别。
The Development of LV Vectors The 2nd Generation
Biosafety issue: Additional accessory genes were deleted (vif, vpu, vpr and nef) The generation of RCL (replication competent lentiviruses) was reduced
八 Advantages and Disadvantages of Lentiviral vectors
1.Potential for long term therapeutic expression: incorporates into the genome of target cells 2.High efficiency gene transduction 3.Transduce several nondividing cells 4.Broad application in vivo / ex vivo 1.Potential for insertional mutagenesis 2.Unable to transduce all nondividing cells (e.g. Hepatocytes) 3.Safety issues 1).HIV-based vectors must overcome a great social barrier 2).Limited knowledge of other lentivirus poses a risk for recombination
七 The Development of LV Vectors The 1st Generation
CMV (cytomegalovirus) immediate-early enhancer/promoter VSV-G (Vesicular stomatitis virus glycoprotein envelope) A cellular polyA was used to replace the 3’ LTR vpu from HIV was deleted
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
重组慢病毒的产生：瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染法如
293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒。此法非常成功，大多实验室采用此法。包膜 质粒、包装质粒与载体质粒共转(多用磷酸钙共沉淀法)染293T细胞直接产生生产细胞。 最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。 例如用以下三质粒来包装产生重组慢病毒：

慢病毒载体的构建
－－Gateway to lentiviral vector

------献给勇敢的斗士
January 2007
Introduction
慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋 白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核， 从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性 使慢病毒成为基因治疗的转移载体。 HIV （Human immunodeficiency virus） 、EIAV （Equine infectious anemia virus） 、 FIV （Feline immunodeficiency virus） 、 SIV （Simian immunodeficiency virus） 。其中研究最多最为透彻 的是HIV。
Fig.1 慢病毒载体的顺式作用元件
四 载体系统的设计
• 慢病毒载体系统由三种不同的组成部分：包装结构、转移载体成分和包膜 蛋白成分（Env表达结构）。 • 包装部分由去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件的HIV-1基因 组而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; • 载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作 用元件,同时具有异源启动子控制下的MCS及在此位点插入的目的基因。 • 三种表达结构均以细菌质粒的形式保存，能转染到哺乳动物细胞内产生复 制缺陷性病毒原种。为降低包装成分和载体成分同源重组产生有复制能力 的慢病毒(RCL) 的可能性, 将包装成分的5ˊLTR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′LTR 换成猿猴空泡病毒40（SV 40）polyA 位点等，而 将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l、另一个表达env。 以HIV-1为基础的慢病毒载体而言，病毒颗粒的核心和酶成分来自于HIV-1, 而包膜蛋白来自于异源性病毒, 大多是水泡性口炎病毒(VSV-G)－－－ •
D0
293T producer cells
Tri-transfection
D1
In the evening
Medium D2 & D3 exchange
Supernatant harvests
Aliquots
Aliquots
Filtration 0.45µ m
1
D3 supernatants
1
D2 supernatants SW28